论文部分内容阅读
细胞因子是由机体相关免疫细胞产生的，具有生物调节和多种生物学功能的活性物质。近几十年，国内外学者热衷于鱼类细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究，结果显示许多种重组细胞因子蛋白如干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-1β(IL-1β)等，都能不同程度的增加灭活苗、弱毒菌、亚单位疫苗等常规疫苗的免疫效应。它在调节免疫应答反应过程中起重要作用，被公认为新型疫苗的较好免疫佐剂。本研究以斑点叉尾鮰白细胞介素-1β（IL-1β）基因为研究对象，成功克隆并表达了IL-1基因重组蛋白;研究了其作为亚单位疫苗佐剂对斑点叉尾鮰的免疫保护效果。 1、斑点叉尾鮰IL-1β基因克隆及原核表达 根据GenBank中公布的斑点叉尾鮰IL-1β1和IL-1β2基因序列（GenBank登录号分别为:DQ160229、DQ160230），运用生物学软件设计特异性引物进行PCR扩增，获得的目的片段IL-邛1和IL-1β2分别克隆至pMD19-T载体;经鉴定正确后用BamHⅠ和XhoⅠ将目的片段从克隆质粒上切出，连接到表达载体pET-32a(+)，获得重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2。然后，将重组质粒转入BL21(DE3)，进而对重组BL21(DE3)细菌进行诱导温度、时间和IPTG浓度优化;最后在最优条件下大量诱导表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白-80℃保存备用;western-blot检测抗体与重组蛋白特异性。结果显示:表达的重组蛋白IL-1β1和IL-1β2均约为48.1Kda，表达的最佳条件为37℃，IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时间为4h; western-blot分析结果表明重组蛋白具有较好的特异性。 2、重组斑点叉尾鮰IL-1β作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究将克隆表达出来的重组蛋白IL-1β1和IL-1β2分别与亚单位疫苗pSCPI等体积混合，通过腹腔注射免疫斑点叉尾鮰，分别于免疫后的第1、2、3、4、5、6、7和8周进行尾静脉采血，测定其血清抗体效价、血清杀菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;另外，在免疫第4周进行攻毒试验，记录统计死亡率和免疫保护率。结果显示，重组白细胞介素-1β(IL-1β)作为亚单位疫苗佐剂能够提高斑点叉尾鮰的血清杀菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;同时，血清杀菌活性结果表明血清中起主要杀菌作用的成分是补体和抗体;佐剂疫苗组和无佐剂疫苗组抗体水平均在第4周达到峰值，其中IL-1β1+IL-1β2对提高亚单位疫苗pSCPI的抗体水平效果最明显，而IL-1β1和IL-1β2对亚单位疫苗pSCPI的影响基本上相同;攻毒后PBS、pSCPI、pSCPI+IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2组累计死亡率分别为:93.33％、46.67％、36.67％、33.33％和23.33％。pSCPI、pSCPI+ IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2组相对保护率分别为:50.1％、61.71％、65.29％和75.01％。实时荧光定量PCR结果显示，佐剂免疫组中IL-1β和TNF-α在头肾和脾脏的相对转录水平均高于无佐剂免疫组和PBS组。