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维生素B12，通常用来表示含钴离子的类咕啉类化合物，尤其是指钴胺素类化合物。它是一种重要的生物活性物质，广泛应用于医药和食品，它是哺乳动物的造血因子，可以用来治疗恶性贫血症，同时它也是许多微生物和动物的生长因子。维生素B12的生物合成仅限一些微生物中，丙酸杆菌菌属和脱氮假单胞杆菌是目前广泛应用于工业化发酵产维生素B12的菌株。本论文是在脱氮假单胞杆菌产维生素B12的需氧合成途径研究基础上，研究菌体生物量、维生素B12中间前体物5-氨基乙酰丙酸和胆色素原、维生素B12合成等之间的相互关系，为脱氮假单胞杆菌发酵过程的控制与优化提供依据。
首先针对原始种子培养基的不足之处，在种子培养基中加入利于种子生长的玉米浆和KH2PO4，并进一步对种子培养基进行优化，使得优化的种子培养基配方下的维生素B12发酵产量提高了46-47％。在此基础上，进一步对发酵培养基进行了优化，维生素B12产量提高了将近31％。
在摇瓶详细考察了外源前体和产物促进剂对维生素B12合成的影响。结果表明，Co2+、5,6-二甲基苯并咪唑作为合成维生素B12的直接前体物能显著提高维生素B12的生物合成量；Zn2+对胆色素原合酶的活性具有促进作用，从而通过提高维生素B12的中间前体物胆色素原的供给，获得更高的维生素B12产量。此外，考察了甜菜碱对菌体生长和维生素B12的影响，实验结果表明，当培养基中不加甜菜碱时，只有极少量的维生素B12中间前体物5-氨基乙酰丙酸的合成，更是没有维生素B12的合成。甜菜碱不仅是维生素B12合成的良好甲基供体，进一步研究发现甜菜碱还能显著提高5-氨基乙酰丙酸合酶的活性，从而通过提高5-氨基乙酰丙酸的供给来促进维生素B12的生物合成。研究还发现甜菜碱会对脱氮假单胞杆菌的菌体生长产生一定的抑制作用，为此在摇瓶中研究了甜菜碱的分批补料工艺。
考察了N源对维生素B12发酵的代谢调控作用。在合成培养基中考察氨基酸对维生素B12合成的影响时发现，谷氨酸对菌体生长和维生素B12合成具有较大的促进作用。根据氨基酸的实验结果，进一步研究了糖蜜工艺中有机氮源对维生素B12发酵的影响，结果表明高浓度的有机氮源会对菌体合成维生素B12产生抑制作用。同时考察了不同无机氮源对维生素B12发酵的影响，发现硫酸铵是维生素B12发酵较为适宜的无机氮源；进一步研究NH4+对发酵过程的影响时发现，高浓度的NH4+明显有利于菌体的生长，但由于会抑制胆色素原脱氨酶的活性，反而降低了维生素B12的生物合成；为克服NH4+在菌体生长与维生素B12合成上的矛盾，在摇瓶中研究了NH4+的分批补料工艺。
在120-m3生产罐中建立了简单而效果显著的pH-stat策略。结果表明，发酵过程的pH在6.9-7.2的范围内最利于维生素B12的合成；通过将补料培养基中的碳源由糖蜜改为葡萄糖、甲基供体由氯化胆碱改为甜菜碱，并且将发酵过程的总糖浓度控制在3.0-4.0g/100mL、甜菜碱浓度控制在0.5-0.7 g/100mL时，菌体能通过自身的生理代谢有效地使发酵过程的pH稳定地维持在7.0-7.2，整个发酵过程不必通过酸碱流加来调节pH。同时对发酵过程的溶氧控制进行了研究，传统的溶氧控制思路认为脱氮假单胞杆菌产维生素B12的整个发酵过程应保持低溶氧，但是本研究表明供氧能力的提高不仅利于菌体的生长，而且促进了中间前体物5-氨基乙酰丙酸和胆色素原的合成，从而提高了维生素B12的产量。在120-m3生产罐中，通过转速和通气量的提高，将溶氧水平由原始发酵工艺下的2％以下提高到10％左右，结果表明溶氧水平的提高不仅提高了表征菌体代谢强度的OUR和CER值，而且最大菌体干重由原始溶氧工艺下的28.80g/L提高到了35.58g/L，维生素B12产量更是由原始溶氧控制工艺下的103.78μg/mL提高到了185.57μg/mL。
最后从发酵原料的角度对放大策略进行了研究。首先对原始糖蜜培养基在120-m3生产罐中的发酵过程进行分析，发现原始培养基中糖蜜用量过大而致使菌体生长缓慢、维生素B12产量低下。通过将摇瓶优化的发酵培养基配方和种子培养基配方应用于生产罐的发酵中，不仅菌体生长得到明显的改善，最终的维生素B12产量由原始培养基配方下的81.84μg/mL(周期160 h)提高到了达到183.15μg/mL(周期168 h)。此外，对120-m3罐中的接种时机进行了考察，结果表明种子的菌体光密度值达到9.0-12.5时为最佳移种时机。从脱氮假单胞杆菌对C、N需求特性以及控制发酵成本的角度出发，成功地建立了以麦芽糖为碳源、玉米浆和硫酸铵为氮源的发酵新工艺，而且该工艺下的维生素B12产量和糖蜜工艺基本相同。