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奶牛乳腺葡萄糖摄取直接影响其泌乳效率。论文以奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究了胰岛素对其葡萄糖摄取的作用及其分子调控机制，为调控奶牛乳腺上皮细胞对葡萄糖摄取，增加乳糖合成，提高奶产量提供理论基础。 1.胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取的影响研究 实验研究了胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞增殖和葡萄糖吸收的影响。培养的细胞达到70％～90％融合时，用饥饿培养基（不含血清和激素）培养24h，分别用不同浓度胰岛素(0、250、500、750、1000ng/mL)处理细胞2h、12h、24h、48h，处理结束后利用CCK8法检测细胞增殖情况。利用葡萄糖氧化酶法获得细胞葡萄糖摄取量。结果表明，与对照组相比，胰岛素显著促进奶牛乳腺上皮细胞增殖，增加细胞葡萄糖吸收，其中最佳浓度为500ng/mL。 2.胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖转运载体GLUT1和GLUT8表达的调控研究 实验采用免疫荧光定量和Western blotting技术，研究了胰岛素刺激对奶牛乳腺葡萄糖转运载体GLUT1和GLUT8表达的影响。培养的细胞达到70％～90％融合时，饥饿培养基培养24h，用500ng/mL胰岛素处理细胞2h、12h、24h、48h，处理结束后收集RNA和蛋白样品，分别测定RNA和蛋白丰度。结果表明:胰岛素可显著性促进乳腺上皮细胞葡萄糖转运载体GLUT8的表达(P＜0.05)，但是对GLUT1的表达未见显著性影响(P＞0.05)。由此推测，胰岛素主要通过增加葡萄糖转运载体GLUT8的表达来增加葡萄糖的摄取。 3.胰岛素促进奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖吸收的分子机制研究 实验利用转染、细胞组分分离(Cell fraction)及Western等技术，并借助共聚焦显微镜，研究了胰岛素对乳腺细胞葡萄糖转运载体分布位置的影响。培养的细胞达到70％～90％融合时，饥饿培养基培养24h，用500ng/mL胰岛素处理细胞30min，收集蛋白样品，用Cell fraction试剂盒分离细胞不同组分，并分别进行Western实验，检测细胞膜GLUT1分布特点。采用Lipofectamine-3000转染表达EGFP-GLUT8，胰岛素处理30min，并用共聚焦显微镜观察GLUT8的分布特点。利用PI3K和MAPK信号通路抑制剂检测胰岛素介导葡萄糖转运载体移位的信号通路。结果表明，在基态（不加任何激素）情况下，大部分葡萄糖转运载体GLUT1分布在细胞膜上，而GLUT8主要分布在细胞质。胰岛素刺激后，GLUT8通过PI3K信号通路介导葡萄糖转运载体向细胞膜发生移位，促进葡萄糖摄取，但未检测到GLUT1的移位。 综上所述，胰岛素可通过促进奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖转运载体GLUT8表达和移位，增加葡萄糖吸收。研究有助于开展奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖营养调控，并为提高乳产量提供了理论依据。