【摘 要】
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由于纳豆激酶具有直接与间接纤溶活性、口服有效、副作用小、半衰期长等优点,自其被发现之日起就成为血栓溶酶研究领域中一个热点,但国内外至今无纳豆激酶新药上市.该论文期
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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由于纳豆激酶具有直接与间接纤溶活性、口服有效、副作用小、半衰期长等优点,自其被发现之日起就成为血栓溶酶研究领域中一个热点,但国内外至今无纳豆激酶新药上市.该论文期望通过对枯草杆菌发酵的纳豆激酶的分离纯化以及理化性质研究,为纳豆激酶开发成为溶栓新药奠定基础.首先,通过纤溶活力、蛋白质测定和SDS-PAGE等分析手段,从3株枯草杆菌中确定最高比活力的JinA7为出发菌株;通过对固体发酵与液体发酵法制备纤溶活性物质比活力和电泳比较,确定前者更适合作为实验室条件下纳豆激酶发酵方法;通过应用改进后的"夹层酶谱法"对纳豆提取液上清进行纤溶活性酶谱分析,证明纳豆提取液中存在多种纤溶活性物质;比较了硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀和高浓度CaCl2、NaCl混合盐沉淀法在去除发酵液上清杂质、沉淀前后纤溶活性物质收率等方面的优劣,并最终确定以33-65％硫酸铵分级沉淀为纳豆提取液柱层析预处理步骤.其次,通过A-50、D.F.F、强阴717、CM.F.F、HZ-802、CAD-40、Butyl Sepharose4B、Serine sepharose 2B、S-200HR、G-75、G150等介质对纳豆激酶分离效果的筛选,确定了以Phenyl Sepharose CL-4B→D.F.F→S200作为分离纯化NK的工艺路线,纤溶活力收率为12.69％,纯化倍数为37.99,NK纯酶的比活力为4262 IU/mg;并在实验室条件下制备了一定量的NK纯酶冻干品.最后,在理化性质研究中发现:纳豆激酶受EDTA-Na2、乙腈强烈抑制;在低离子强度水溶液中能够自我降解;纤溶活力被酸性介质强烈地抑制;酶活受温度、金属离子影响;直接纤溶作用占其总活力(直接纤溶+间接纤溶作用)50％以上等.
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