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背景和目的:创伤性脑损伤(Traumatic brian injury,TBI)是威胁人类生命的重大疾病,具有高致残、致死特点,目前尚缺乏有效的药物干预手段。TBI病理生理机制复杂,继发的凝血功能障碍(TBI associated coagulopathy,TBI-AC)及血脑屏障破坏被认为与其不良预后相关。前期研究发现,TBI急性期粘附配体血管性血友病因子(von Willibrand factor,VWF)水平升高且粘附活性增强,通过与脑源性微囊泡(brain-derived microvesicles,BDMVs)结合,协助BDMVs破坏血脑屏障及引起TBI-AC。有研究证明纯化的VWF-A2片段可抑制血小板与VWF以及血小板与纤维蛋白的相互作用。本研究拟通过重组质粒转染、表达、纯化获得高纯度重组VWF-A2蛋白,腹腔注射干预TBI小鼠。探索VWF-A2对TBI小鼠血脑屏障及凝血系统的影响,同时探索其可能的作用机制,为TBI患者药物治疗提供新思路。方法:(1)通过重组质粒转染、表达、纯化获得重组VWF-A2蛋白(组氨酸标签标记)。通过凝胶电泳、蛋白质印迹法及金属酶ADAMTS-13体外酶切实验对VWF-A2进行鉴定和初步功能性研究。(2)通过液压打击仪制备C57BL/6J小鼠重型TBI模型,伤后30 min腹腔注射VWF-A2(4 mg/kg),检测不同时间点VWF-A2循环血浓度。评估VWF-A2对TBI小鼠伤后3天内死亡率的影响,改良版神经功能评分评估神经功能预后。(3)伊文氏蓝渗漏实验检测TBI小鼠血脑屏障通透性。苏木精-伊红染色评估TBI小鼠肺组织血管渗出情况。流式细胞术检测循环血MVs水平。Transwell小室系统和免疫荧光染色技术检测VWF-A2对TBI小鼠外周血源性MVs及体外冻融匀浆法制备的BDMVs介导的内皮屏障破坏的影响。(4)酶联免疫吸附试验检测TBI小鼠循环血VWF抗原、D-二聚体和纤维蛋白原含量及VWF结合胶原能力。磷钨酸-苏木精染色评估TBI小鼠肾脏纤维素沉积情况。凝血酶生成实验和活化凝血因子X凝血时间检测MVs介导的凝血反应。流式细胞仪和血细胞计数仪检测血小板激活水平及血小板计数。小鼠断尾流血时间检测TBI小鼠出血倾向。(5)免疫共沉淀法及表面等离子体共振技术检测TBI小鼠循环血及体外VWF与VWF-A2相互作用。同时评估VWF-A2对瑞斯托霉素辅因子活性和剪切力诱导的血小板聚集的影响。结果:通过VWF-A2重组质粒转染、表达、纯化成功获得大量高纯度重组VWF-A2蛋白(纯度90-95%),金属酶ADAMTS-13可有效酶切VWF-A2,证明了其具有生物学活性。VWF-A2可减少TBI后循环血中携带VWF的脑源性、血小板源性及内皮细胞源性MVs释放,抑制VWF协助下BDMVs介导的血脑屏障破坏及内皮细胞激活,同时降低了TBI小鼠死亡率,改善存活小鼠神经功能预后。同时,VWF-A2可减少TBI后高活性VWF的释放并能抑制其粘附活性,减轻VWF引起的血小板激活及血小板减少症。此外,VWF-A2对凝血及纤溶级联反应也有抑制作用,表现为减轻了MVs介导的凝血酶生成及活化凝血因子Xa凝血反应,D-dimer水平下降,纤维蛋白原水平上升,并且缓解了TBI后出血倾向但不引起正常老鼠出血倾向。最后,通过体内、体外实验证实VWF-A2可结合到活化VWF暴露的A1结构域,抑制其活性,表现为减轻瑞斯托霉素或剪切力诱导的血小板聚集。结论:本研究成功纯化重组VWF-A2蛋白,证明VWF-A2可减轻TBI小鼠血脑屏障及凝血系统损害,降低死亡率,改善神经功能预后。其神经保护机制可能是结合并抑制了TBI后释放的高活性VWF功能,提示了其作为药物开发的可行性,为TBI药物治疗提供新思路。同时,VWF-A2还可能成为特异性检测高活性VWF的新手段,用于诊断血栓性血小板减少性紫癜、严重感染等疾病。