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猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)是一种猪群高度接触性呼吸道传染病病原菌,可以引发猪传染性胸膜肺炎(PCP);副猪嗜血杆菌(Hps)是定殖于猪群上呼吸道的正常菌群和机会致病菌,能引起猪群发生副猪嗜血杆菌病,此两种疫病均严重危害养猪业的发展。目前构建APP和Hps两种病原菌免疫原基因的减毒缺失株已经成为两者疾病新型疫苗的重要研究方向。本试验以APP血清5型菌为亲本株,构建了嵌合Hps血清5型HS80株ompP2基因的APP apxⅠC基因缺失突变株,并对其生物学特性和免疫原性进行相关研究。
1、嵌合Hps基因的APP缺失突变株重组转移载体的构建:重组转移中间载体pBOSK△IC-1的构建:以APP血清5型SC-1株基因组为模板扩增apxⅠC基因下游1434bp序列为右同源臂,在其上游加入SpeI和MluI位点,将扩增的片段TA-克隆至pMD19-T Simple,经PCR鉴定得到一条1400bp左右的片段,经双酶切鉴定正确。双酶切获得目的片段,并用其置换pBOSK△IC原有右同源臂,经PCR鉴定得到一条1400bp左右的片段,经双酶切鉴定得到分别为1400bp和7000bp左右的片段,证明本试验改造载体pBOSK△IC,在其右同源臂上游插入MluI酶切位点,成功构建了重组转移中间载体pBOSK△IC-1。
重组转移载体pBOSK△IC/ompP2的构建:以Hps血型5型HS80株基因组为模板扩增ompP2基因片段1107bp序列,将扩增的片段TA-克隆至pMD19-T Simple,经PCR鉴定得到一条约为1100bp左右片段,且双酶切和测序鉴定均正确。双酶切目的片段,连接到重组转移中间载体pBOSK△IC-1,经PCR鉴定得到一条约为1100p左右片段,双酶切鉴定得到两条分别为1100bp和8500bp左右条带,证明本试验用1107bp的Hps ompP2基因插入重组转移中间载体pBOSK△IC-1,成功构建了嵌合Hps ompP2基因的重组转移载体pBOSK△IC/ompP2。
2、嵌合Hps基因的APP基因缺失突变株的构建:将重组转移载体pBOSK A IC/ompP2电转入APP血清5型SC-1感受态,进行第一次同源重组,从含卡那霉素的TSA平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落,再将PCR鉴定得到两条分别为1400bp和800bp左右的条带,经抗性实验证明正确的菌株转移含蔗糖的TSA平板,进行第二次同源重组,筛选含有蔗糖抗性菌落做PCR鉴定得到一条约为1400bp的片段,证明本试验成功筛选得到一株嵌合Hps ompP2基因的APP apxⅠC基因缺失突变株,命名△apxⅠC/ompP2。
3、突变株AapxⅠC/ompP2的生物学特性和免疫原性研究:生长特性试验证实突变株△apxⅠC/ompP2的生长与亲本株没有显著区别;遗传稳定性试验证实其在体外连续传10代后基因仍能稳定遗传;溶血试验证实其在体外培养不表现溶血活性;细胞毒性试验证实其细胞毒性较亲本株减弱;通过小鼠半数致死量的LD50测定,突变株为1.0×107CFU,亲本株为3.5×106CFU,相差30倍,对小鼠的毒性明显降低;在免疫保护试验中,免疫过突变株的小鼠能对20倍LD50的亲本株提供100％的保护,对5倍LD50的Hps HS80提供62.5％的保护;通过ELISA检测免疫小鼠血清证实其能诱导小鼠产生对APP和Hps的抗体,并在三免后抗体浓度达到最高。这些试验均表明,该突变株的毒力明显降低,能对APP的感染提供较全面、有效保护的同时对Hps的感染也表现出一定的保护能力,为进一步研究该突变株作为减毒株的实际应用奠定了基础。