论文部分内容阅读
在我国，胃癌是发生率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一，侵袭和转移是导致死亡的主要因素。因此深入探讨胃癌侵袭和转移机制，寻找胃癌侵袭转移相关的分子，对胃癌的治疗及预后具有重要的意义。
microRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，长度为18～22nt，它能在转录后水平抑制靶基因的表达或翻译，广泛地参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等重要的生物学过程。大量文献表明microRNA可作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生和发展。在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用。
研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)在胃癌的表达水平比正常胃黏膜高，且与胃癌的侵袭深度和淋巴结转移、复发呈正相关;患者血清中TGF-β1水平的升高与预后呈负相关。本课题组前期的研究亦发现TGF-β1可以促进胃癌细胞BGC823和SGC7901细胞的侵袭和转移，因此为进一步探讨TGF-β1促胃癌侵袭转移的机制，本课题拟以microRNA芯片分析TGF-β1处理后对胃癌细胞miRNA表达谱的影响并初探差异表达miRNA分子的功能及其作用机制。目前国内外未见相关文献报道。
目的:检测TGF-β1刺激后胃癌细胞microRNA差异表达谱的变化，探讨差异表达microRNA分子—miR-193b在胃癌侵袭和转移过程中的作用和机制，为以miR-193b作为靶点的胃癌基因治疗提供理论基础和实验依据。
方法:
1.使用microRNA芯片检测TGF-β1刺激胃癌细胞后microRNA表达谱的变化。以胃癌细胞BGC823、SGC7901和MKN28为研究对象，使用real-time RT-PCR验证差异表达的microRNA在三株不同分化，对TGF-β1刺激敏感和抵抗的胃癌细胞中的表达水平。
2.运用TargetScan，PicTar和miRanda软件对差异表达的microRNA进行生物信息学分析，预测差异表达的microRNA可能的分子作用靶点及其相关的信号通路。
3.将带有荧光标记化学合成的miR-193b mimic和inhibitor分子分别瞬时转染胃癌细胞，使用荧光倒置显微镜肉眼观察各组细胞内荧光的数量，real-time RT-PCR检测空白转染组、阴性转染组、转染组各组细胞中miR-193b的表达，以证实转染效果。
4.使用Transwell迁移、侵袭实验、划痕实验和裸鼠腹腔肝脏转移瘤形成实验检测miR-193b mimic、miR-193b inhibitor瞬时转染和对胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力的影响。
5.以各组转染细胞为研究对象，使用real-time PCR、RT-PCR及Western blotting方法检测miR-193b mimic和inhibitor转染前后miR-193b，uPA mRNA和uPA蛋白表达水平之间的关系，以确定uPA是否为miR-193b在胃癌细胞中的作用靶点。
结果:
1.TGF-β1刺激胃癌细胞BGC82324h和36h后，在两个不同时间点出现了6个共有的差异表达的microRNA。其中miR-193b，miR-574-3p和miR-130b表达下调，而miR-27a，miR-29b-1和miR-194表达上调。这6个差异表达的microRNA被视为与胃癌的侵袭转移相关。
2.miR-193b mimic和inhibitor瞬时转染明显的上调和下调胃癌细胞BGC823中miR-193b的表达水平。miR-193b inhibitor瞬时转染能够增强胃癌细胞BGC823的运动、迁移、侵袭和转移能力。而miR-193bmimic瞬时转染则具有抑制作用。
3.uPA可能是miR-193b的直接靶基因，miR-193b在转录后水平抑制uPA蛋白的表达。
结论:
1.首次运用microRNA芯片和realtime PCR技术对TGF-β信号通路、胃癌的侵袭转移和miRNA三者的相关性进行分析研究，并发现了TGF-β1促胃癌侵袭转移的新机制。
2.实验证明6个差异表达的microRNA与胃癌细胞的侵袭转移及TGF-β信号通路相关。
3.TGF-β1促进胃癌细胞侵袭转移的作用可能是通过TGF-β1下调miR-193b的表达，miR-193b减少对uPA转录后翻译的抑制，上调uPA的蛋白表达从而促进胃癌细胞的运动、迁移、侵袭和转移。