GABA能系统在小鼠精原干细胞中的功能研究

• 作 者: 杜昭
• 机 构: 中国科学院大学
• 出 处: 中国科学院大学
• 发表日期: 2014年期
• 关键词: γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶 精原干细胞 氯离子通道 负调控因子

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中一种主要的抑制性神经递质，也存在于很多的外周组织中，在组织发育过程中有重要功能。GABA、GABA合成酶——谷氨酸脱羧酶(Glutamic Acid Decarboxylase，GAD)、GABA受体、GABA转运蛋白(GAT)等组成的调控网络，称为GABA能系统。其中，GAD包括GAD65和GAD67两种不同的酶，GABA受体分为GABAA受体和GABAB受体。除神经系统外，GABA能系统也存在于哺乳动物雄性生殖系统中。在出生后6天的小鼠睾丸内，我们发现GABA和GAD在生精小管中含量较高。在成年小鼠睾丸内，我们发现GAD67除了在间质细胞表达以外，还在各类型的精原干细胞(SSC)中表达，而GAD65则没有表达。这预示着GABA信号参与体内调节SSC的一些生理功能。在未成年小鼠睾丸和附睾发育过程中，随着年龄的增长，GAD的表达量有一个显著的变化。在体内研究精子发生很困难，而利用体外培养的SSC来替代则提供了一种便捷的方式。在体外，可以对SSC的许多基因进行敲除或敲低实验，但是由于缺乏睾丸的内环境，SSC向精子分化的体外诱导过程很困难。为此，我们需要将体外培养的精原干细胞重新移植回小鼠睾丸内，借助睾丸里适合分化的内环境，重新启动SSC向精子的分化，并在这一过程中，观察各个阶段生殖细胞的表型。为研究GAD67在精子发生中的功能，我们初步建立了利用RNAi技术将SSC中GAD67敲低并将这些SSC移植回睾丸的方法。在移植之前，我们先给小鼠腹腔注射白消安，以消除受体睾丸中原有的生殖细胞的影响。　　在SSC中，我们检测到了GABAB受体的R1亚基有微弱表达，但由于缺乏R2亚基，所以无法形成有功能的GABAB受体。接着我们又检测了GABAA受体的各个亚基，发现α1、α5、β1、β2、β3、γ3这些在睾丸中表达的亚基在SSC上也有表达。膜片钳实验证实了SSC上的GABAA受体能够结合GABA，开启氯离子通道。为了直接检测GABA对SSC的影响，我们用GABA和GABAA受体激动剂来处理SSC。利用有丝分裂标记分子——组蛋白H3丝氨酸10位点磷酸化(pH3)的抗体，我们发现GABA和GABAA受体激动剂都能抑制SSC增殖，这一过程不依赖于细胞凋亡。这些结果表明GABA是SSC自我更新和维持自我稳态的负调控因子。