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纳米纤维比表面积大、制备简单以及宏观呈膜形态等特性,使其做为固定化酶的载体具有独特的优势和良好的工业应用前景。目前用于固定化酶的纳米纤维多为有机高分子材料,而生物相容性更好的无机材料,如基于TiO2、SiO2的纳米纤维尚未被广泛应用。本论文结合溶胶凝胶-静电纺丝技术制备出TiO2纳米纤维,并将其用于固定化碱性蛋白酶Protex6L,在有机相中催化重要的生物表面活性剂脂肪酸糖酯的合成反应；同时还首次尝试用于包括辅酶的多酶体系的固定化,进行胆汁酸的分析检测。具体研究包括如下几个方面:
(1)结合溶胶凝胶法和静电纺丝技术,制备TiO2纳米纤维。考察了电压和电纺液流量对纳米纤维平均直径及形貌的影响。在电场强度1.8 kV cm-1,电纺液流速为500μLh-1时,所制备出的纳米纤维平均直径为125 nm且分布均一。
(2)利用碱性蛋白酶Protex6L,在叔戊醇/二甲基亚砜混合溶剂中催化月桂酸乙烯酯与蔗糖的转酯化反应制备月桂酸蔗糖酯。首先考察了底物加入方式对反应速率的影响,蔗糖以粉末形式最后直接加入反应体系中时,反应效率最高。采用响应面法对影响糖酯合成的主要因素:温度、溶剂中水含量以及Protex6L的pH值进行优化,得到最佳实验条件为:43℃、3.4％的含水量和pH10.0的Protex6L冻干粉,在此条件下响应面的预测和验证试验得到的糖酯合成初速率分别为8.7 mg.mL-1.h-1和8.66mg.mL-1.h-1。在最佳实验条件下,1.5 mg.mL-1的游离的Protex6L在9 h内可以将98％的蔗糖转化为糖酯。这一结果远高于其他常用于蔗糖酯合成的固定化脂肪酶,包括Novozym435,Lipase AK,Lipase Candida Rugosa,以及蛋白酶Proleather。
(3)利用TiO2纳米纤维固定化Protex6L并用于月桂酸糖酯的合成,对固定化条件和合成反应条件进行了优化,载酶量达到201mg.g-1时，比活力最高为2.45μmol.h-1.mg-1；在50℃和5％水含量的反应条件下,经过36 h的反应,基于蔗糖的转化率为97％,产率为Novozym435的34倍。考察固定化Protex6L的重复使用性表明,酶膜重复使用10次,剩余活性为52.4％。
(4)本论文构建了可用于胆汁酸检测的包括3α-羟基类固醇脱氢酶、黄递酶和辅酶NADH的多酶偶联体系,并首次尝试将纳米纤维用于该多酶体系的固定化。采用2,6-二氯酚靛酚作为黄递酶的底物,胆汁酸浓度为10μmol.L-1和50μmol.L-1,反应2 h后体系在600 nm下的吸光度值改变分别为0.017和0.05。初步证实了多酶偶联反应的进行,但是反应效率还有待进一步提高。