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研究目的肝癌是一种致死率较高的常见恶性肿瘤疾病。我国是肝癌大国,占世界肝癌患者的半数以上。由于多数患者在确诊时已经处于中晚期且肝癌异质性较大,大多数患者治疗效果不良、预后较差。揭示肝癌的发病机制、探寻有效的治疗方式是目前肝癌研究领域的焦点。肿瘤复发和转移是导致肝癌患者预后较差的主要风险因素。门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombosis,PVTT)是一种常见肝癌并发症,由肝癌肿瘤细胞侵润肝门静脉形成。肝癌伴发门静脉癌栓患者预后较差。揭示癌栓的发生机制,了解癌栓发生的根本原因能够帮助寻找辅助肝癌治疗的新疗法改善患者预后。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是表观遗传学调控机制中的重要一环。大量的研究已经证实lncRNA分子在肿瘤发生和转移中发挥着重要的作用。另外,肿瘤干细胞是导致肿瘤复发和转移的主要因素。研究已经表明肝癌肿瘤干细胞是导致肝癌复发和转移的罪魁祸首。lncRNA及肿瘤干细胞在肝癌的发生和转移过程中发挥着重要的作用,但两者在肝癌转移特殊类型——门静脉癌栓发生中的作用及具体的相关机制未见文献报道。本研究的主要目的为:1)揭示门静脉癌栓特异的基因表达谱;2)探讨lncRNA及肝癌肿瘤干细胞在门静脉癌栓发生中的作用并揭示其发挥作用的分子机制。探讨lncRNA及肿瘤干细胞作为治疗靶点,在肝癌合并门静脉癌栓治疗中应用的可能性。研究方法针对本课题的研究内容采用如下研究方法:1.门静脉癌栓特异表达谱分析。采用cDNA芯片检测门静脉癌栓组织及相应的肝癌组织的基因表达情况,并利用相应的肿瘤细胞系进行验证。基于差异表达基因分析,采用GO富集分析等方法分析门静脉癌栓组织异常的信号通路,探讨门静脉癌栓发生的分子机制。2.门静脉癌栓特异表达lncRNA分子筛选。以cDNA芯片差异表达分析结果为基础,采用生物信息学软件Blat寻找门静脉癌栓组织及门静脉癌栓细胞系CSQT-2特异高/低表达的lncRNA分子中,同差异mRNA在序列上有相似/互补的lncRNA分子,寻找候选lncRNA分子。3.门静脉癌栓特异表达lncRNA分子表达验证。采用SYBRGreen实时定量PCR方法检测候选lncRNA分子在肿瘤组织及肿瘤细胞系中的表达。RACEPCR结合生物信息学方法分析lncRNA分子的编码潜能。采用荧光原位杂交方法检测lncRNA分子在肿瘤细胞中的分子定位,便于后续分析其分子功能。4.门静脉癌栓特异表达lncRNA分子功能分析。采用过表达载体/特异靶向干扰RNA序列(siRNA)转染肿瘤细胞的方法在肿瘤细胞中上调/下调候选lncRNA分子的表达。在调控表达的基础上采用增殖/转移等功能实验,在体外检测候选lncRNA分子的功能。建立小鼠皮下荷瘤模型在体内检测候选lncRNA分子的功能。5.门静脉癌栓特异表达lncRNA分子表达调控机制探讨。生物信息学分析结合chip方法寻找候选lncRNA分子上游转录调控因子。采用过表达载体/siRNA转染方法对转录调控因子进行功能获得/缺失实验,然后采用sybrgreen实时定量PCR方法检测候选lncRNA分子的表达情况,以此来探讨候选lncRNA分子表达异常的分子机制。研究结果cDNA芯片分析发现门静脉癌栓组织、肝癌肿瘤组织及癌旁对照各自具有特异的编码RNA和长链非编码RNA分子表达谱。门静脉癌栓细胞系CSQT-2和肝癌肿瘤细胞系Hep3b也具有特异的编码RNA和长链非编码RNA分子表达谱。go富集分析和kegg信号通路富集分析结果显示门静脉癌栓组织异常表达的基因涉及到氧化还原反应、细胞增殖、药物代谢反应、细胞黏附及免疫反应等生物学过程。肿瘤组织cDNA芯片结果同肿瘤相关细胞系cDNA芯片结果对比分析发现有32条lncRNA分子和26条mRNA分子在两种肿瘤组织和相应的肿瘤相关细胞系中表现出一致的表达模式。blat软件分析发现这些分子中lncRNA分子lnc24236和ICAM-1mRNA之间有大约800bp连续的碱基互补配对。实时定量PCR结果显示lnc24236和ICAM-1在门静脉癌栓组织和细胞系CSQT-2中的表达水平分别高于对应的肝癌组织和肝癌细胞系Hep3b。在门静脉癌栓细胞系CSQT-2和肝癌肿瘤细胞系(Hep3b、Huh7)中,上调/下调ICR的表达水平导致ICAM-1mRNA和蛋白发生相应的上调/下调。肝癌肿瘤细胞系Hep3b上调ICR后,其转移能力明显增强。门静脉肿瘤细胞系CSQT-2中下调ICR后,ICAM-1mRNA的稳定性降低、ICAM-1蛋白表达减少。Hep3b细胞中上调ICR后ICAM-1mRNA的稳定性升高、ICAM-1蛋白表达升高。定量PCR检测发现肝癌肿瘤组织及肿瘤细胞系来源的ICAM-1+肿瘤细胞中,ICR的表达水平明显高于相对应的ICAM-1-肿瘤细胞。肝癌肿瘤细胞中,下调ICR的表达能够明显减少ICAM-1+肿瘤细胞的比率,降低肿瘤细胞在体外悬浮培养中生成悬浮球的能力。在肿瘤模型小鼠体内,皮下荷瘤原位注射靶向ICR的siRNA表达病毒导致ICR和ICAM-1表达下降、肿瘤组织中ICAM-1+肿瘤细胞比例降低、肿瘤生长减缓。nanog能够结合到ICR上游DNA序列中。在肝癌细胞系中上调/下调nanog的表达能够上调/下调ICR的表达水平。结论肝癌门静脉癌栓组织具有不同于原发肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织的独特基因表达谱。lncRNA分子ICR为门静脉癌栓组织及相应肿瘤细胞系CSQT-2中特异性表达升高的lncRNA分子。ICR通过与ICAM-1 mRNA分子结合形成RNARNA复合物增加ICAM-1 mRNA分子的稳定性,进而上调ICAM-1分子在肿瘤细胞中的表达。ICR能够促进肿瘤细胞发生转移、增强ICAM-1+肝癌肿瘤干细胞自我更新能力。Nanog能够直接结合到ICR上游DNA区域,激活ICR在肿瘤细胞中的表达。