胡蜂(Vespa mandarinia)来源的膜穿孔毒素的分离、纯化、鉴定以及功能试验

来源 :中国科学院生物物理研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wwk504
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研究表明有毒动物及昆虫导致的过敏反应病例中膜翅目昆虫蜜蜂、胡蜂及马蜂占绝大多数,这些昆虫的广泛分布及其叮咬导致的严重临床症状使得其研究具有重要的临床意义。中国大虎头蜂(Vespa mandarinia)是世界上最大的胡蜂,其毒素会导致溶血、凝血障碍以及横纹肌溶解等由此宏观表现为皮肤瘙痒、剧烈的疼痛以及严重的水肿等临床症状,然而胡蜂毒素导致这些症状的具体分子机制还不是特别清楚,在临床治疗中缺乏胡蜂叮咬中毒后的诊断标志物以及快速有效的治疗手段,治疗预后不容乐观。细胞膜是构成人类表面生物屏障的重要基础,胡蜂毒液导致的严重水肿等症状正是基于对细胞膜的破坏。利用G50分子筛以及反向高效液相色谱我们从胡蜂粗毒中纯化到一个细胞膜穿孔活性多肽,我们将其命名为VESCP-M2,利用MALDI-TOF质谱分析以及Edman降解N端测序我们获得了该多肽分子的分子量及氨基酸序列信息。NCBI比对发现该多肽为首次被发现,其半胱氨酸构型同已报到的细胞因子趋化肽(Chemotactic peptides)一致。基于氨基酸的一级序列信息我们利用Discovery Studio3.1模拟了该多肽的结构,并使用膜片钳技术对该多肽的电生理特性进行了研究,内膜向外(Inside-out)膜片钳记录方式下,低浓度毒素的灌流能记录到单通道电流发放,提示该多肽能在膜上聚合为孔道,全细胞(Whole-cell)记录下,高浓度的多肽灌流能记录到巨大的漏电流,能直接观察到细胞被大量穿孔后裂解,同时,外膜向外(Outside-out)和内膜向外(Inside-out)膜片钳记录方式下VESCP-M2的活性保持一致,提示VESCP-M2在细胞膜上的作用没有膜的方向选择性。接下来我们利用动物试验验证了VESCP-M2的促炎反应,试验结果表明VESCP-M2能引起动物持续且严重的水肿和组织坏死,在坏死组织及水肿液中我们检测到了大量的载脂蛋白A-1以及炎症因子,坏死组织的免疫组化结果观察到了大量的角蛋白产生以及炎症细胞侵润,这些结果提示VESCP-M2能引发强烈的组织损伤和炎症反应。本研究从胡蜂毒素中鉴定到了一条膜穿孔多肽毒素VESCP-M2,对该多肽的研究揭示了胡蜂毒素造成人严重临床症状如水肿、组织损伤等的分子机制,并为胡蜂叮咬提供了临床干预治疗的分子基础。
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