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脑胶质瘤占颅内原发肿瘤的第一位，具有浸润性的生长和侵袭性强的特点，因此外科手术很难将其完全切除。残存的肿瘤细胞会引起复发，严重影响治疗效果。术后的放化疗虽可以有效地杀伤残存的肿瘤细胞，但同时也会损伤正常组织和引起不良反应，疗效也不甚满意。因此，积极探索其它有效的方法对于提高脑胶质瘤治疗效果具有重要意义。 光动力学疗法(PDT)是一种新兴的治疗方法，其原理是光敏剂可特异性的聚集于肿瘤组织内并可被特定波长的激光所激活，在此过程中产生一系列有细胞毒性的活性分子如活性氧(reactive oxygen species。ROS)、单线态氧分子等，这些活性分子可直接诱导肿瘤细胞死亡。第一代光敏剂Photofrin所介导的PDT治疗(photofrin-PDT)在多种恶性肿瘤治疗中均显示了良好的效果，因此欧美多个国家已批准PDT用于一些恶性肿瘤的治疗。在脑胶质瘤方面，临床研究初步表明photofrin-PDT照射后肿瘤组织会发生坏死和凋亡，患者生存时间延长。但Photofrin-PDT在临床治疗中有很多不足之处，如photofrin的皮肤毒性很大，半衰期长，患者需避光6.18周等，大大限制了其使用。 5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一代新型的光敏剂前体物质，是体内血红素合成过程中的一种中间产物，ALA在ALA脱氢酶、尿卟啉原合成酶(PBGD)、原卟啉原Ⅸ氧化酶等的作用下经尿卟啉原、粪卟啉原形成具有光敏剂性质的原卟啉Ⅸ(ppⅨ)，原卟啉Ⅸ在亚铁鳌合酶的作用下形成血红素。因肿瘤细胞中PBGD的活性或表达远高于正常细胞，而亚铁螯合酶的活性又低，所以PpⅨ在肿瘤细胞中的含量会明显的高于正常细胞。正是因为肿瘤细胞对PpⅨ的异常蓄积使得ALA-PDT能够对其进行特异性的杀伤，而对正常细胞却无明显损伤。另外，ALA的临床副作用小，表现为皮肤毒性小，半衰期短，患者只需避光2天。因此ALA介导的PDT治疗(ALA-PDT)是一种非常具有应用前景的局部治疗肿瘤的方法。虽然目前其对胶质瘤治疗作用并不清楚，但在我们的前期研究中发现ALA-PDT治疗大鼠脑胶质瘤效果良好。 但随着研究的深入我们发现ALA-PDT治疗后在肿瘤的周边及周围区域，组织会因缺氧(在PDT治疗过程中，需消耗大量的氧，因此造成局部组织缺氧)诱导缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和其下游的靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)的表达增高。鉴于VEGF具有强烈的促进内皮细胞增殖、新血管形成的作用，我们推测如果高表达的VEGF促进新生血管形成，而在此区域又有残存的肿瘤细胞，那么新生的血管可帮助肿瘤细胞快速生长，导致肿瘤复发。但目前我们未见此方面的报道。 贝伐单抗(bevacizumab)是美国Genentech公司开发的一种针对VEGF的单克隆抗体性药物，通过与VEGF高亲合力的结合来抑制VEGF与其受体结合，从而抑制VEGF的生物学活性。在肿瘤组织中，贝伐单抗可通过抑制VEGF的生物学活性减少新生血管的形成，降低氧气和营养物质的供应，从而抑制肿瘤的生长。贝伐单抗于2004年获美国食品药品管理局批准一线治疗晚期直结肠癌，是第一个被批准的以抑制血管生成为主要治疗手段的抗肿瘤药物。 本研究旨在探讨ALA-PDT照射能否通过HIF-1α/VEGF诱导新生血管的形成，新生的血管可否加速脑胶质瘤的生长；贝伐单抗是否能通过抑制VEGF来抑制ALA-PDT诱导的上述反应；ALA-PDT联合贝伐单抗是否可提高裸鼠脑胶质瘤的治疗效果及其作用机理，为ALA-PDT联合贝伐单抗临床治疗脑胶质瘤提供实验和理论依据。本课题共分三部分： 1.ALA-PDT照射对正常裸小鼠脑组织新生血管形成的影响 高(80 J/cm2)、低(10 J/cm2)剂量的AL-PDT照射裸小鼠右侧大脑皮层，在PDT照射后第1、5、10天，每组随机选取9只小鼠处死。拟行冰冻切片和振荡切片处理的裸小鼠处死前2 min经尾静脉注射0.1 ml异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC，50 mg/ml)。在免疫荧光显微镜下以495 mm波长荧光激发冰冻切片血管中的FITC，观察脑血管二维图像，在激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM)下以495 mm波长荧光激发振荡切片血管中的FITC，通过重构程序建立脑血管三维立体图像，并用定量分析程序测量扫描区域血管的分支点数目、每段血管的长度和直径，观察ALA-PDT对正常脑组织新生血管形成的影响。新生血管的直径和分支点数目显著增加而长度下降。通过western blot方法检测PDT照射区域内HIF-1α和VEGF的表达，以探讨其作用机理。 结果：免疫荧光显微镜观察裸鼠脑冰冻切片，脑血管发出绿色荧光，以PDT照射区对侧大脑相应区域的脑血管为对照。在10 J/cm2组照射后第1和5天，脑血管形态与对照组相比无显著性差异；但在第10天，照射区血管增粗、结构紊乱，提示有新生血管形成；在80 J/cm2组照射后第1天，脑血管的形态与对照组无显著性差异；但随着时间的延长，照射区有异常的新生血管形成。用图像分析软件定量分析LSCM扫描后重建的脑血管三维立体图像，验证了脑血管二维图像的结果，在10 J/cm2组照射后第1和5天，脑血管无明显变化；但在第10天，照射区血管分支点数目增加、血管直径增粗、长度下降，提示有新生血管形成；在80 J/cm2组照射后第1天，脑血管无明显改变；但随着时间的延长，照射区有异常的新生血管形成。Western blot结果表明在10 J/cm2组，照射后第1天照射区VEGF的表达与对侧相应区域无明显的区别，但在照射后第5和10天，照射区VEGF的表达逐渐增高(P<0.05)；在80 J/cm2组，照射后第1天照射区VEGF的表达即明显高于对侧的相应区域(P<0.05)，且随着时间的延长，表达也逐渐增高；照射后第1天，VEGF在80和10 J/cm2组间的表达无区别；但在第5和10天，80 J/cm2组的VEGF高于相应时间点的10 J/cm2组，差异具有显著性(P<0.05)。Western blot法检测HIF-1α发现，无论是低剂量(10 J/cm2)还是高剂量(80 J/cm2)PDT照射后第1天，照射区组织内HIF-1α的表达即高于对侧的相应区域(P<0.05)，而且这种表达随PDT剂量的增大和照射后时间的延长而逐渐增高。 2.贝伐单抗对ALA-PDT诱导的新生血管形成和促胶质瘤生长的作用 60只裸小鼠随机分为4组，分别为对照组、PDT组、贝伐单抗组和联合处置组(PDT+贝伐单抗)。对照组不予处置，PDT组和联合处置组在第1天接受10 J/cm2的ALA-PDT照射右侧大脑皮层；贝伐单抗组和联合处置组分别在第1、3、5、7天腹腔注射贝伐单抗(5 mg/kg)。第10天每组随机选取9只小鼠处死，用免疫荧光双标法和Western blot法检测照射区的VEGF表达，观察不同的预处置对VEGF表达的影响；利用二维免疫荧光和LSCM扫描后重建的脑血管三维立体图像观察新生血管形成情况。每组剩余6只裸鼠在PDT照射区的相应位置种植U87脑胶质瘤细胞，种植后第21天取出脑组织，H.E.染色，测量肿瘤体积，观察不同预处置后大脑局部微环境改变对胶质瘤生长的影响。 结果：脑血管二维图像发现较对照组相比，贝伐单抗组的血管无明显变化，但PDT组的照射区域内血管增粗，结构紊乱，说明有异常的新生血管形成，与PDT组比较，联合处置组的血管形态明显正常化。脑血管三维立体图像经分析软件定量分析验证了脑血管二维图像的分析结果。免疫荧光双标法发现VEGF阳性定位于血管壁，半定量检测显示与对照组比较(22.19±5.45‰)，贝伐单抗组的VEGF的阳性区域比率(18.82±4.37‰)无明显变化，但PDT组(137.28±10.49‰)表达明显增高(P<0.01)，而这种增高在联合处置组被抑制(37.74±7.63‰，P<0.01)。Western blot定量分析VEGF的表达情况，结果表明VEGF在对照组和贝伐单抗组表达极低，但在PDT组的表达异常增高(P<0.01)，这种增高在联合处置组被抑制，结果与免疫荧光双标法的一致。不同方法预处置后第10天再种植U87细胞，3周后对照组、PDT组、贝伐单抗组和联合处置组的肿瘤体积分别为8.29±2.12 mm3、16.87±3.93 mm3、4.63±1.49 mm3和9.14±3.08 mm3，统计分析表明与对照组相比，贝伐单抗预处置后的肿瘤缩小(P<0.05)。PDT组的肿瘤体积明显大于对照组，但联合处置组的肿瘤体积较PDT组比较减小，说明贝伐单抗可以抑制PDT所诱导的肿瘤生长。 3.ALA-PDT联合贝伐单抗治疗裸鼠U87胶质瘤的实验研究 30只裸小鼠脑内接种5.0×105个U87细胞后随机分为5组(n=6)，分别为对照组、替莫唑胺组、PDT组、贝伐单抗组和联合治疗组(PDT+贝伐单抗)。除对照组外，种植后第7天各组开始接受相应的治疗：替莫唑胺组替莫唑胺(50 mg/kg)灌胃，连用5天；PDT组和联合治疗组接受80 J/cm2ALA-PDT照射肿瘤；贝伐单抗组和联合治疗组分别在种植后第7、10、13、16天腹腔注射贝伐单抗(5 mg/kg)。种植后第21天取出脑组织，利用H.E。染色检测肿瘤体积，观察不同治疗方法对裸鼠脑胶质瘤的情况；通过免疫组化法检测胶质瘤细胞Ki67指数和肿瘤周围VEGF表达情况，TUINEL染色法检测肿瘤细胞凋亡情况，以初步探讨其作用机理。 结果：裸小鼠脑内立体定向种植U87细胞后第21天，对照组、替莫唑胺、PDT、贝伐单抗及联合治疗组的肿瘤体积分别是8.85±1.94mm3、4.35±0.86mm3、4.96±0.94mm3、3.58±0.75mm3和1.76±0.41mm3，统计分析表明与对照组相比，各治疗组的肿瘤体积均明显缩小(P<0.05)，其中联合治疗组的疗效最明显(P<0.05)，优于替莫唑胺组、单独的PDT组和贝伐单抗组。免疫组化染色测定对照组和PDT组中Ki67指数分别为54.29±6.53％和52.82±7.73％，两者之间无明显差异(P>0.05)。但替莫唑胺、贝伐单抗及联合治疗组的Ki67指数与对照组比较均有不同程度下降，分别为43.49±4.86％、27.79±3.08％和28.95±3.11％，差异具有显著性(P<0.05)。其中联合治疗组的Ki67指数降低最明显，低于替莫唑胺组。TUNEL染色显示对照组中仅有少量细胞发生凋亡，阳性细胞数为20.43±3.38/mm2，与对照组比较，替莫唑胺、PDT、贝伐单抗及联合治疗组的阳性细胞数不同程度增高，分别是49.56±5.47/mm2、48.56±7.89/mm2、51.08±8.05/mm2、78.95±11.02/mm2，差异具有显著性(P<0.05)。与替莫唑胺组、单独的PDT组和贝伐单抗组相比，联合治疗组作用最明显(P<0.05)。免疫组化检测肿瘤周围VEGF的表达，对照组的阳性区域比率为10.53±1.93‰，与对照组相比，替莫唑胺对VEGF表达无影响(13.324±1.86‰)，贝伐单抗减少了VEGF表达(5.87±0.82‰)，PDT显著增加了其表达(21.16±3.88‰)，但这种增高在联合治疗组中被抑制(6.85±1.22‰)。 结论： 1.在治疗脑胶质瘤方面，ALA-PDT是一种非常具有应用前景的方法，但本研究发现ALA-PDT照射后可诱导正常脑组织HIF-1α、VEGF表达增高和新生血管形成。 2.在经ALA-PDT照射的正常脑组织区域，U87脑胶质瘤生长速度加快，分析除了细胞损伤因素外，可能与ALA-PDT诱导新生血管形成有关。 3.贝伐单抗能够抑制ALA-PDT诱导的VEGF表达增高，新生血管形成和U87脑胶质瘤的生长。 4.ALA-PDT联合贝伐单抗治疗可明显抑制U87脑胶质瘤的生长，抑制作用高于替莫唑胺、ALA-PDT和贝伐单抗。作用机理包括直接抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、通过减少PDT照射后诱导的新血管形成来间接抑制细胞的生长。