【摘 要】
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,简称GABA）作为一种非蛋白质氨基酸,广泛存在于动物、植物及微生物体内。GABA是哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静安神、控制哮喘、治疗癫痫等,因此GABA作为一种生物活性因子,在食品及医药行业具有广泛应的应用前景。本论文对棉子糖肠球菌（Enterococcus raffinosus）TCCC11 6
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,简称GABA）作为一种非蛋白质氨基酸,广泛存在于动物、植物及微生物体内。GABA是哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静安神、控制哮喘、治疗癫痫等,因此GABA作为一种生物活性因子,在食品及医药行业具有广泛应的应用前景。本论文对棉子糖肠球菌（Enterococcus raffinosus）TCCC11 660菌株通过发酵与转化法生产GABA进行了系统研究。以前期筛选获得一株产GABA的棉子糖肠球菌TCCC11660为供试菌株,对摇瓶培养基及发酵罐培养条件进行了优化;对菌株细胞内的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase;GAD）进行了分离纯化,并对其酶学性质做了初步研究,并对GAD的固定化条件进行了优化。1.以棉子糖肠球菌TCCC11660为出发菌株,经多功能等离子体诱变系统（MPMS）诱变处理,经筛选获得了一株GABA高产突变株E12,经摇瓶发酵72 h,GABA产量达43.36 g/L,比野生型菌株提高了 16.7%。经10次连续传代后培养,突变株遗传性状稳定,无回复突变现象。2.通过单因素实验、Plackett-Burman实验设计、Box-Behnken响应面设计,确定了最佳的培养基组成（g/L）:蔗糖40,酵母粉30,谷氨酸钠（L-MSG）40,乙酸钠 4,K2HPO4 2,MgSO4 0.2,（NH4）2SO4 0.6,柠檬酸 8.9,甘氨酸 0.82,磷酸吡哆醛0.21 mmol/L,pH 4.5。在此发酵条件下,摇瓶GABA产量达77.5 g/L,比初始培养基提高了 76.5%。3.在5 L发酵罐中对影响菌株合成GABA的主要因素（溶氧、pH和温度）进行了研究。结果表明,GABA发酵的最适条件为:兼性厌氧条件下,培养温度30℃,0-16 h不控制pH,16 h后控制pH 4.5。在此基础上对GABA的补料发酵进行的初步研究,具体参数为:发酵培养基3 L,接种量10%（v/v）,搅拌转速100 r/min,培养温度30℃,0-16 h不控制pH,16 h使用6 mol/L的H2SO4后控制pH 4.5。当底物浓度低于20 g/L时,补料100 g L-MSG。经72 h补料分批发酵,GABA浓度达到142.6 g/L。4.对菌株细胞中的GAD进行了分离纯化,建立了有效的分离纯化GAD的工艺流程,即溶菌酶处理、超声破碎、超滤离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析。纯化得到1.698 mg GAD蛋白,收率为8.3%,纯化倍数32.3倍,纯化后的GAD 比酶活为21.7 U/mg;经SDS-PAGE及凝胶过滤层析得到的GAD分子量分别为55 kDa及110 kDa。对纯化后的酶学性质做了初步研究,最适温度和pH分别为45℃、4.6,酶的Km和Vmax分别为5.26 mmol/L 与 3.45 μmol/L/min。5.最后,对利用海藻酸钠固定化GAD的条件进行了研究。经单因素及正交实验得到最佳固定化条件为:海藻酸钠3%,CaCl22.5%,固定化时间4 h,戊二醛浓度0.4%,酶活收率为59.7%。iGAD最适pH为5.0,最适温度50℃。经反复7次使用后,iGAD酶活残留为65.2%。
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