去甲斑蝥素抗结肠癌及血管新生作用的实验研究

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[目的]:研究去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的作用,通过超声造影(contrast-enhancedultrasonography,CEUS)、管道形成实验、免疫组化、病理检测等实验技术,探讨NCTD对荷瘤裸鼠瘤体生长影响,并从血管新生角度探讨其抗肿瘤的作用机制,为临床中医药治疗结肠癌提供理论依据。  [方法]:通过管道形成实验探讨NCTD对人脐静脉血管内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)网络状结构形成的影响,评估离体血管生成情况,从而快速筛选血管生成抑制剂。同时建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,将30只裸鼠随机分为5组:NCTD高、中、低剂量组(NCTD-H组、NCTD-M组、NCTD-L组)、5-氟尿嘧啶组(5-FU组)及生理盐水组(NS组),瘤体长至1.5-2cm时腹腔注射给予高中低剂量组不同浓度的NCTD(28mg/kg、14mg/kg、7mg/kg)、5-FU(24mg/kg)及NS(0.2ml/只),2次/w,连续用药4w。用药结束,经裸鼠尾静脉注射超声造影剂声诺唯(SulphurHexafluorideMicrobubblesforInjection,SonoVue),造影模式下观察瘤体位置、大小、造影剂充填情况、瘤体内部坏死情况等。保留实验图像,将造影图像直接动态传入CAP(ClinicalApplicationPackage,SonoLiverRCAP)工作站,通过SonoLiverRCAP软件分析时间强度曲线(time-intensitycurve,TIC)。造影结束,称取裸鼠重量,处死裸鼠并剥离瘤体,测量瘤体重量及长短径,计算瘤体抑制率,HE染色检测肿瘤组织坏死情况,行免疫组织化检测肿瘤组织微血管密度(Microvasculardensity,MVD)。  [结果]:  1.HUVEC管道形成实验较真实的模拟细胞生长和血管再生的环境,通过倒置显微镜观察HUVEC网络状结构形成,发现各剂量组NCTD均可抑制HUVEC网络状结构形成,且呈剂量依赖性,NCTD可抑制HUVEC血管再生。  2.实验发现,不同剂量的NCTD均可抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长,NCTD高中低剂量组瘤体抑制率分别为71.1%、50.0%、40.7%,呈剂量依赖性。其中NCTD-H组体积小于NCTD-L组,差异有统计学意义(P<0.01);NS组瘤体体积最大,差异有统计学意义(P<0.01),但治疗前后裸鼠体重无明显差异。  3.通过SonoLiverRCAP造影分析软件得出,各实验组瘤体造影剂上升时间(risetime,RT)、达峰时间(timetopeak,TTP)、平均通过时间(meanTransitTime,mTT)均短于同深度正常组织。各组肿瘤组织TTP均短于相应正常组织(P<0.01),NCTD高剂量组TTP时间较NCTD中低剂量组长,NS组造影达峰时间最短,差异有统计学意义(P<0.01),但NCTD-H组与5-FU组,NS组与NCTD-L组差异无统计学意义(P>0.05)。  4.根据CD31阳性情况判断MVD值,NCTD高中低各剂量组MVD值较NS组小,NCTD可抑制肿瘤微血管形成,但与5-FU组相比,差异无统计学意(P>0.05)。  [结论]:  1.NCTD可抑制HUVEC网络状结构形成,抑制HUVEC血管新生,呈剂量依赖性;  2.人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型是评价药物对人结肠癌疗效的理想模型;  3.NCTD可抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长,且呈剂量依赖性,可能与抑制肿瘤血管新生相关;  4.CEUS评价肿瘤血管新生,无创、简单、快速,是在体评价肿瘤血管新生及药物疗效的新方法。
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