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化橘红为芸香科(Rutaceae)柑桔属(Citrus)植物，其未成熟或近成熟的干燥外层果皮是传统的名贵中药。化橘红果皮中分布有大量的分泌囊，有效成分分布于其中，但是化橘红有效成分具体的合成场所和积累动态还不十分清楚。关于柑橘类植物分泌囊的发生方式，尽管先前的研究已经证明分泌囊以裂溶生方式发生，分泌细胞的破毁是细胞程序性死亡的结果，但是有关分泌囊细胞程序性死亡的作用机理方面的研究知之甚少。 针对以上问题，本研究中以道地药材化橘红(Citrus grandis cv.Tomentosa)为研究材料，运用冰冻切片技术和组织化学染色技术对化橘红有效成分进行了组织化学定位；运用半薄切片和超薄切片技术研究了化橘红果实分泌囊的结构特征，发生和发育特点，以及分泌囊发育过程中超微结构的变化规律；同时还运用LM-和EM-TUNEL对分泌囊细胞程序性死亡过程中的DNA断裂的时空变化规律进行了详细的研究，在此基础上还利用免疫组织化学和免疫细胞化学技术研究了caspase3-like凋亡蛋白酶在分泌囊发育过程中的时空定位特点。这些研究为合理利用和保护中药化橘红提供了科学依据，更重要的是为揭示柑橘属分泌囊的起源和发生提供了丰富详实的科学资料，为caspase3-like参与分泌囊的细胞程序性死亡提供了新的细胞学证据，为进一步研究植物细胞程序性死亡的分子机理提供了丰富的细胞学资料。现将主要结果陈述如下： 1化橘红有效成分的组织化学定位 化橘红中的主要有效药用成分为黄酮类物质，其次为挥发油。因为果实作为化橘红入药的主要部位，因此我们采用了组织化学的方法来观察果实中黄酮类物质和挥发油的分布和贮藏的部位。结果表明：黄酮类物质主要分布在分泌囊的原始细胞或者分泌囊腔周围的鞘细胞和薄壁细胞中；挥发油在上皮细胞中合成，主要贮藏在分泌囊腔中，其次在外果皮的茸毛中含有少量的挥发油。 2化橘红分泌囊的分布及发育 除根和种子外，化橘红的茎、叶、花及果实中都有分泌囊分布。根据化橘红果实分泌囊发育过程中组织学和细胞学变化特点，将其划分为5个阶段：原始细胞阶段前期、原始细胞阶段后期、胞间隙发生阶段、空腔扩大阶段和成熟阶段。 化橘红果实分泌囊起源于子房壁或者幼果的一个表皮细胞和其下的一个薄壁细胞，形成分泌囊的前体细胞。前体细胞经过不均等分裂形成分泌囊的原始细胞团，此时期为原始细胞阶段前期。接着分泌囊的原始细胞团进一步分化出帽区和球区，进入原始细胞阶段后期。随着分泌囊的发育，在球区中央3-5个细胞间以裂生的方式形成腔隙，进入胞间隙形成阶段。接着靠近腔隙的上皮细胞的小液泡融合形成中央大液泡，之后上皮细胞破毁，以溶生方式扩大腔隙。最终形成由1-2层生活的上皮细胞围绕着充满挥发油的腔道，分泌囊进入成熟阶段。 3化橘红果实分泌囊腔以裂溶生方式形成 原始细胞阶段前期，细胞核大且饱满，核仁明显。在原始细胞阶段后期，部分细胞核开始出现降解的特征，如核膜内陷，染色质不同程度的凝集、边缘化，细胞核失去饱满的形态等。在胞间隙形成阶段，核仁更加不明显，甚至降解消失，凝集的染色质逐渐解体消失。在空腔扩大阶段，核膜破裂，细胞核被分解为几部分，最终消失：在细胞核降解的同时，其他细胞器也开始表现出降解的特点，如质体膨胀变形，部分线粒体内脊消失，内质网末端膨大等。通常在细胞核降解消失后，上皮细胞中的小液泡融合形成中央大液泡。然后中央大液泡破毁，已经开始降解的质体、线粒体、内质网等细胞器快速解体，消失。最后细胞壁断裂，整个细胞破毁。从分泌囊发育过程中组织学和细胞学变化特点来分析，化橘红果实分泌囊是以裂溶生的方式形成，并且上皮的破毁在形态上表现出典型的细胞程序性死亡的特点，主要包括染色质的凝集、染色质的边缘化、细胞核和其他细胞器有序的解体、液泡的破毁等。 4细胞程序性死亡参与了化橘红果实分泌囊的裂溶生过程 为了研究分泌囊细胞的破毁是否具有细胞程序性死亡典型的生化的特征-DNA片段化。我们运用光镜-和电镜-原位末端标记检测技术对分泌囊发育过程中DNA片段化进行了检测。原始细胞阶段前期，染色质还没有开始凝集，在核仁和核质中已经出现了微弱的DNA片段化的信号。原始细胞阶段后期，细胞核内的DNA片段化明显增多，主要分布在凝集染色质上。胞间隙发生阶段，更多的上皮细胞的细胞核中出现了DNA片段化，但靠近腔隙的上皮细胞的核仁开始降解，凝集的染色质减少，DNA片段主要分布在残存的核仁和凝集染色质上。空腔扩大阶段，靠近空腔的上皮细胞的细胞核大量降解，少量断裂的DNA片段随机的分布于降解的核质中。分泌囊成熟阶段以后，在分泌囊细胞中几乎检测不到DNA片段。从分泌囊发育过程中形态学和生化特点来看，上皮细胞的破毁应该是细胞程序性死亡的结果。我们的研究从细胞学水平揭示出在细胞程序性死亡过程中DNA片段化主要发生在凝集染色质中。 5 Caspase3-like调控了分泌囊细胞的程序性死亡 为了探讨分泌囊中细胞程序性死亡相关的作用机理，我们运用caspase-3抗体对分泌囊发育过程中caspase3-like进行了组织学和细胞学定位研究。结果表明：原始细胞阶段前期，已有了明显的caspase3-like信号，caspase3-like的胶体金颗粒主要分布在核质和染色比较深的染色质中。原始细胞阶段后期，caspase3-like信号明显增多，并主要分布在凝集染色质上。胞间隙发生阶段，靠近分泌腔的1-2层上皮细胞黄褐色的沉淀信号显著增强，此时细胞核进入降解后期，可见胶体金颗粒随机的地分布于核质中，同时，在破毁的核膜区域有明显的胶体金分布。另外，在细胞核的降解过程中，在部分变形的线粒体膜上，膨胀的内质网和降解的质体中也有胶体金颗粒分布。在空腔扩大阶段，随着上皮细胞逐渐由内向外解体，靠近空腔的上皮细胞中caspase3-like信号逐渐减弱。进入分泌囊成熟阶段，上皮细胞检测到很少量的黄褐色沉淀信号，鞘细胞无信号出现。上述结果显示caspase3-like凋亡蛋白酶不但参与了分泌囊细胞程序性死亡，而且在细胞程序性死亡的染色质凝集、边缘化，DNA片段化，细胞核变形和解体，及除液泡外其它细胞器的降解等方面起到了重要的作用。