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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起结核病,是微生物中人类最大的敌人,据世界卫生组织预测全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的数据显示,2011年全球新发现有870万感染者患病,其中有110万患者同时感染艾滋病毒,估计有140万人死于结核病。因与艾滋病毒共同感染人体造成死亡的数目之巨,MTB已成为传染病中的头号杀手。虽然现已开发几种抗结核类药物但由于耐药性的产生,这些药物的控制效果远远达不到令人满意的效果。结核病是一个从未解决的麻烦。DNA双链断裂是普遍存在的一种DNA损伤,但其对于细胞来说是致命的。修复DNA双链断裂的途径有同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳动物细胞中发现的,并一直被认为只存在于真核生物中,其在真核生物中对保持基因组的稳定性有很重要的作用。但之后的研究发现NHEJ也普遍存在于一些病原微生物中,且与耐药和免疫逃避相关。现已知NHEJ修复途径涉及两个蛋白LigD和Ku,同时对这两个蛋白的功能也有了一定的了解,而在NHEJ修复过程中,LigD同Ku的作用机制及调控方式还不是很明确。本实验室前期研究发现去乙酰化酶Sir2可能参与NHEJ修复途径,还发现Ku的29位赖氨酸有乙酰化修饰,这暗示了NHEJ修复的调控可能同Ku的K29乙酰化修饰有关。我们以耻垢分枝杆菌做为模式生物使用无标记基因敲除法来构建ligD和ku两个基因的不同突变体ligD ΔPolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。无标记基因敲除需要两个质粒,一个质粒为p1NIL,为目的基因提供多克隆位点,第二个质粒pGOAL,含有一个两端为PacI酶切位点的标记基因盒。标记基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。构建成的自杀质粒含有pGOAL质粒的标记基因盒和修饰过的目的基因,最后经过两次筛选得到我们所要的突变体。实验结果发现同源臂的长度、碱处理质粒时碱的终浓度、沉淀DNA溶液的pH等条件和第二次筛选的扩增培养时间等都影响双交换法突变株的构建。同时也发现M. smegmatis Ku的C端加His标签不影响其参与的NHEJ活性,这为后面检测耻垢分枝杆菌ku突变株(kuR29-his和kuQ29-his)的NHEJ活性时,消除His标签引起NHEJ活性改变的影响。这些突变体为研究NHEJ修复的调控方式提供了重要的材料。