论文部分内容阅读
以近年从浙江、四川等地分离到的鸡传染性支气管炎病毒肾致病型毒株以及传统的IBV经典毒株为材料,设计特异性引物,分别克隆了IBV的S1基因和N基因并测定序列,用DNAstar等软件进行分析。S1基因和N基因的序列比较显示,国内分离到的部分毒株间同源性最高(82.9%到98.6%),但它们与传统的毒株相比同源性较低。在分离株的S1基因和N基因序列中均发现了大量散在的点突变,而且在SC021202株和J株的Sl基因中发现一段长21nt的插入片段,在以前的毒株中不存在。这些特征显示国内近年流行的一些IBV毒株是新的变异株,有着相对独立的起源和进化方向。 在大肠杆菌pBAD/his系统中表达了IBV的N蛋白,表达量约占菌体总蛋白的20%。同时在大肠杆菌pGEX表达系统中高效表达了IBV S蛋白的S1F表位片段和SlD表位片段。大肠杆菌中表达的N蛋白和S1蛋白均可与IBV多抗血清发生特异性反应,并通过Ni柱纯化出了表达的外源蛋白。此外,还将IBV S1基因构建到酵母表达载体pPICZ α B中,电转化酵母X33菌株,得到四个阳性克隆,经甲醇诱导可分泌型其中三株可表达IBV的S1糖蛋白,表达的蛋白可与多抗血清发生特异性反应。 以纯化到的N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法(N-ELISA),可以检测出鸡血清中的抗IBV N蛋白的特异性抗体。对N-ELISA的反应条件进行了优化,包被液以PH 8.5的Tris-HCI包被效果最佳,抗原包被量确定为0.19 μg/孔,一抗(待检血清)的稀释度确定为1:100,酶标二抗HtRP标记的兔抗鸡IgG)确定为l:800。用N.EL,ISA检测IBV及其他病原的抗血清,结果证实N-ELISA可检测出针对各IBV毒株的抗体而其它病原的抗血清均检测为阴性,说明N-ELISA具有良好的特异性,此外,用N-ELISA与IDEXX公司的ELISA试剂盒同时检测临床样本95份,两种方法检出的总阳性率符合率达到95.7%。以表达的SlF为包被抗原,通过类似的方法建立了间接ELISA方法(SlF-ELISA),可以检测出鸡血清中抗S蛋白的特异性抗体。抗原包被浓度确定为0.6 μg/孔,一抗和酶标二抗的稀释度分别为l:50和l:800。SlF-ELISA可以检测针对不同毒株的IBV的抗血清而其他病原体的抗血清均较检测为阴性说明SlF-ELISA具有理想的特异性。用SlF-ELISA检测来自临床的免疫鸡血清样本34份,与IDEXX试剂盒的结果比较,其阳性率均为100%。 以纯化的N蛋白、S1D蛋白、S1F蛋白分别免疫BALB/e小鼠,通过杂交瘤技术制备除了8株抗N蛋白的单克隆抗体、3株抗S1D蛋白的单克隆抗体、6株抗S1F的单克隆抗体。抗体亚类鉴定显示17株单抗均为IgG1,K链。通过western