环状RNA在小鼠脊髓损伤后的表达和抗凋亡功能分析

• 作 者: 姚颖
• 机 构: 浙江大学
• 出 处: 浙江大学
• 发表日期: 2020年期
• 关键词: 脊髓损伤

目的：环状RNA(circRNAs)是一类新型的内源非编码RNA，目前已被公认为在基因表达和某些疾病的病理过程中起着重要的调节作用。本论文旨在研究脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后circRNAs的变化以及在继发性损伤神经元凋亡中的作用。
　　方法：首先通过微阵列芯片分析技术筛选SCI3天后小鼠脊髓组织中circRNAs和mRNAs表达谱(每组n=4只)。同时，采用qRT-PCR随机选取差异表达circRNA和mRNA进行验证。TUNEL染色检测脊髓组织的凋亡。采用Westernblot检测脊髓组织中凋亡相关蛋白Bcl2、BAK和BAX的表达。然后，结合mRNA表达数据，通过基因本体论(Gene ontology, GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析预测差异表达的circRNAs的潜在功能。最后，采用生物信息学方法分析与凋亡相关的circRNAs，包括与microRNA结合位点鉴定，以及构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。选取表达增加最多的circRNA，既cicRNA.7079，采用功能缺失实验，干扰慢病毒感染小鼠脊髓运动神经元样细胞NSC-34，以氯化钴(CoCl2)刺激模拟体内缺氧损伤，CCK-8检测神经元活性，流式细胞术检测神经元凋亡。
　　结果：芯片检测结果显示，与假手术组相比，SCI3天后脊髓组织中共有1131个circRNAs和2309个mRNAs的表达发生了变化(变化倍数＞2倍，p＜0.05)，包括909个上调的circRNAs和222个下调的circRNAs，以及1806个上调的mRNA，503个下调的mRNAs。QRT-PCR随机检测4个circRNAs和2个mRNA，表达趋势与芯片结果一致，验证了芯片表达的可靠性。TUNEL染色证实脊髓损伤3天后细胞凋亡增加。Westernblot证实促凋亡蛋白BAK和BAX的表达显著升高，而抗凋亡蛋白Bcl2的表达显著降低。对差异表达的circRNAGO和KEGG富集分析，结果发现差异表达circRNAs的宿主基因主要参与SCI后的继发性损伤，其中148个差异表达的circRNAs与脊髓损伤后凋亡有关。经过FISH原位杂交技术证实cicRNA.7079主要分在NSC-34胞浆内。CCK-8检测显示敲低cicRNA.7079的表达对神经元的活性有抑制作用，流式细胞术检测显示敲低cicRNA.7079的表达，可增加CoCl2诱导的NSC-34的凋亡数目。
　　结论：本项研究揭示了小鼠SCI3天的circRNAs和mRNAs的表达谱，阐明了这些差异表达的circRNAs在SCI继发性损伤中与凋亡、自噬和炎症关系。并确认cicRNA.7079具有抗凋亡作用，可能为SCI的抗凋亡治疗提供潜在的circRNA层面的策略。