论文部分内容阅读
能够分离单个病毒是研究单个病毒基因的首要前提条件，然而由于技术限制，目前还不能够在大气环境中精确分离特定的单个病毒以便对其进行详细研究。本文旨在建立基于原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)纳米操纵与聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)相结合的技术，实现对单个腺联重组病毒血清2型(recombinant adeno-associated virus serotype2，rAAV2)病毒颗粒进行精确的挑选、分离与扩增。
病毒颗粒易于在衬底表面上积聚，阻碍了AFM对单个病毒颗粒的分析和研究。实验中发现，在rAAV2溶液中添加少量甘油(浓度在1～3％间为佳)或是戊二醛(浓度为2％)均可制备出在云母衬底上病毒颗粒分散性很好的样品，为后续单个病毒的分离与研究奠定了良好基础。
建立分离软物质以及改造针尖以便提高分离纳米粒子成功率的技术。为解决在实际操作中病毒颗粒易于被针尖碾压在衬底表面的难题，本文建立了确定针尖适宜下降距离的参考方法，使针尖能够与病毒颗粒在特定位置进行接触，从而较好的拾取到完整病毒颗粒；通过摩擦针尖和使用poly(dimethylsiloxane) PDMS包被针尖的方法增大针尖曲率半径，增加针尖与纳米粒子间的黏附力，提高了分离成功率。
提出PCR检测单个病毒颗粒的策略。在扩增过程中，通过两轮扩增技术成功扩增出针尖分离的单个病毒颗粒的核酸，扩增产物经过测序证明其是rAAV2病毒核酸。文中详细叙述了扩增单个病毒的技术细节以及如何解决阴性污染的策略。
本论文通过大量翔实的实验证明了使用AFM分离单个病毒颗粒具有直观、操作方便和快速等特点，验证了使用PCR检测单个病毒颗粒的可行性。在实验中相继解决了病毒颗粒在衬底表面积聚的问题，以及应用AFM分离软样品的若干技术，并同时深化研究了单个病毒颗粒核酸的PCR扩增策略，为进一步探讨单个病毒的研究提供了有力技术支持。