论文部分内容阅读
目的:帕金森病(parkinson’s disease, PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,主要病理特点是中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和纹状体区多巴胺(dopamine, DA)水平减少。临床上以进行性加重的运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势步态异常等为特征。近年来研究表明帕金森病患者不仅有运动障碍,而且有逐渐进展的认知功能下降,并伴有一定的焦虑、抑郁情绪,严重者出现痴呆,称为帕金森病痴呆(Parkinson’s disease with dementia, PDD),严重影响了患者的生活质量[1]。传统的药物治疗和外科手术方法只能部分改善症状,长期疗效并不乐观,而细胞移植已成为目前研究的热点。骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)取材方便,来源充足,可在短时间内大量扩增,并可进行自体移植,避免了异体间移植可能引起的免疫排斥和伦理道德上的争议,这些优点均使其成为理想的种子细胞。脑内注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)制作PD模型常用于研究PD的运动功能障碍及疗效的观察,近年来人们开始关注其认知功能障碍。而目前研究多将BMSCs立体定向移植到6-OHDA所致PD模型大鼠的纹状体,可有效改善大鼠的旋转行为,但尚未见有侧脑室移植BMSCs治疗PD模型的报道。我们将6-OHDA注射于单侧黑质致密部和腹侧被盖区制成PD模型,对PD模型运动和认知两方面的改变进行观察,并将同种异体来源的BMSCs在体外扩增培养后,立体定向移植到6-OHDA所致PD大鼠的侧脑室,观察侧脑室移植BMSCs对PD大鼠的运动和认知功能的影响。方法:①动物:封闭群清洁级健康雌性Sprague Dawley (SD)大鼠由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:正常成年SD大鼠60只,腹腔注射阿朴吗啡(apomorphine, APO)淘汰有旋转行为的大鼠1只,Morris水迷宫淘汰有记忆障碍的大鼠2只后,随机取8只大鼠归入正常组,其余大鼠用水合氯醛麻醉,利用立体定向仪单侧黑质致密部和腹侧被盖区注射6-OHDA制作右侧PD模型,手术后3周腹腔注射APO诱导其旋转,旋转次数大于7r/min的视作制模成功。将成功的34只PD模型大鼠随机分为BMSC组16只、PBS组10只、模型组8只。选取BMSC组大鼠右侧侧脑室(坐标:前囟后1.5mm,矢状缝右侧1.0mm,硬膜下3.8mm)为注射点,注入经Brd-U标记的BMSCs悬液10μl (约1.0×106个细胞),PBS组同法于大鼠右侧侧脑室注入等量磷酸缓冲液(PBS),模型组和正常组不作任何处理。③实验评估:细胞移植后连续8周观察APO诱导的PD大鼠旋转行为的变化;制模前、制模成功后(即细胞移植前)、细胞移植后第4周、细胞移植后第8周分别进行Morris水迷宫测试,对各组大鼠的认知功能进行评价。侧脑室移植后第1、3、7天及移植后8周各取两只BMSC组大鼠,对脑侧脑室区连续冠状石蜡切片进行免疫组织化学染色,检测BrdU阳性细胞。细胞移植后8周,取各组大鼠脑黑质区连续冠状石蜡切片免疫组化染色检测酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase, TH)阳性细胞。结果:①PD大鼠运动功能改变:与移植前比较,细胞移植后第1-8周腹腔注射APO诱导BMSC组PD大鼠的旋转次数明显减少,转数从移植前的(13.5±4.9)r/min降到移植后第8周的(8.7±3.8)r/min,移植前后的数据相比,差异有统计学意义(P<0.05);PBS组和模型组移植前旋转次数分别为(15.1±3.9)r/min、(17.8±3.4)r/min,移植后第8周分别为(18.1±4.0)r/min、(19.7±4.8)r/min,移植前后差异无统计学意义(P>0.05)。与PBS组和模型组比较,APO诱导BMSC组PD大鼠的旋转次数从第1周开始就有明显减少(P<0.05),从第3周即有显著减少(P<0.01);PBS组和模型组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。②认知功能改变:制作模型前,BMSC组、PBS组、模型组、正常组四组大鼠的寻台潜伏期、在原平台所在象限所占时间百分比、路程百分比、穿越平台次数均无统计学差异(P>0.05)。制模成功后即细胞移植前,与正常组相比,BMSC组、PBS组、模型组三组大鼠的寻台潜伏期均显著延长(P<0.05),在原平台所在象限所占时间百分比、路程百分比、穿越平台次数均显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);而BMSC组、PBS组、模型组三组之间无差异(P>0.05)。细胞移植后第4周和细胞移植后第8周,BMSC组的寻台潜伏期与PBS组、模型组相比显著缩短(P<0.05),在原平台所在象限所占时间百分比、路程百分比、穿越平台次数均显著增加(P<0.05),与正常组相比,差异无统计学意义(P>0.05);PBS组、模型组与正常组相比,寻台潜伏期明显延长(P<0.05),在原平台所在象限所占时间百分比、路程百分比、穿越平台次数均显著减少(P<0.05);而模型组与PBS组相比,上述指标均无显著性差异(P>0.05)。③免疫组织化学染色结果:BMSC组在侧脑室移植BMSC后第1天可见侧脑室壁与脉络丛存在大量BrdU阳性细胞,移植后第3天可见细胞沿胼胝体有少量迁移,移植后第7天依然可见脉络丛中散在的阳性BrdU细胞,并且在胼胝体、脑室外侧的周围脑实质均可见散在的阳性细胞,而在移植后8周时未见有明显阳性细胞。移植后第8周BMSC组、PBS组、模型组的6-OHDA注射侧黑质区TH阳性神经元和神经纤维表达基本缺失。结论:①BMSC组移植后APO诱导的PD大鼠旋转行为从第1周即有明显改善,并且可以持续至少8周。②单侧黑质致密部和腹侧被盖区注射6-OHDA制成的PD模型大鼠有明显的认知障碍,主要表现在空间参考和空间工作记忆的下降。③侧脑室移植BMSCs可明显改善6-OHDA所致PD大鼠的认知功能障碍。④B MSCs侧脑室移植可存活并迁移至胼胝体和脑室外周的脑组织。结果提示BMSCs可能适合应用于临床蛛网膜下腔的自体移植。