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目的:肺癌的发病率逐年增高,已经成为我国死亡率最高的恶性肿瘤,其中85%-90%是非小细胞肺癌。造成非小细胞肺癌致死率高的重要原因之一是转移的高发。目前,大多数非小细胞肺癌患者确诊时已发生转移。因此,研究非小细胞肺癌的转移机制,考察参与其中的关键节点与分子通路,将有助于了解非小细胞肺癌的进展,从而寻找合适有效的干预策略,提高肺癌的治疗效果。本课题基于实验室前期研究结果,结合Oncomine数据库中非小细胞肺癌病人样本表达谱,发现醛酮还原酶AKR1C1在非小细胞肺癌病人中表达异常。进一步采用多种细胞和分子生物学手段研究醛酮还原酶AKR1C1在肺癌转移中的作用与分子机制,并在裸小鼠模型中明确醛酮还原酶AKR1C1对转移的促进和推动作用,以期为肺癌的治疗提供潜在靶点和全新干预策略。方法:(1)通过基因芯片数据对比分析高转移细胞株T4和亲本细胞株TO的基因表达情况,挖掘潜在的驱动转移的基因;(2)通过临床病人样本的数据库分析,考察潜在的促转移基因AKR1C1在肺癌中的表达情况,及AKR1C1所参与信号通路与临床病人风险的相关性;(3)采用Western Blot技术,考察AKR1C1相关蛋白及信号通路和磷酸化情况;(4)采用Real-Time PCR技术,考察STAT3靶基因及转移相关基因的mRNA的表达情况;(5)采用siRNA转染技术沉默AKR1C1,观察STAT3的磷酸化水平,细胞的运动能力,及STAT3靶基因的mRNA的表达情况;(6)采用质粒转染技术高表达AKR1C1,考察细胞的运动能力,及STAT3靶基因的mRNA的表达情况;(7)采用免疫荧光技术,观察AKR1C1及相关蛋白的核内核外分布情况;(8)采用免疫共沉淀技术,考察AKR1C1是否和STAT3之间存在结合;(9)采用SRB技术,考察STAT3抑制剂对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制情况,进而选取没有增殖抑制的浓度用于考察STAT3抑制剂对非小细胞肺癌细胞的迁移运动能力的影响;(10)采用Transwell实验,进一步考察细胞的侵袭运动能力;(11)采用裸小鼠尾静脉注射细胞的模型,考察AKR1C1的促转移作用;(12)采用PET-CT技术,考察裸小鼠体内的肿瘤灶点数量及分布情况。结果:1、模型高转移细胞株T4/T0的基因芯片数据提示AKR1C1可能是一个潜在的促转移基因实验室前期通过Transwell小室富集的方式,建立了一株具有高转移性状的T4细胞株。对T4/T0的基因芯片数据进行分析,在T4相对于亲本T0表达上调的基因中,AKR1C1排名第二,提示AKR1C1可能有潜在的促转移作用。AKR1C1的这一功能并未被报道,因此我们将进一步明确这一效应,并研究潜在机制。2、AKR1C1在非小细胞肺癌病人的临床样本中,表达增高在Oncomine数据库中,通过条件筛选,我们发现,在非小细胞肺癌病人(腺癌,鳞癌,大细胞癌)的临床样本中,AKR1C1的mRNA水平表达高度上调。提示AKR1C1和非小细胞肺癌的进展有一定的相关性。3、多株非小细胞肺癌细胞株中,AKR1C1的本底表达水平鉴于在不同的肿瘤细胞株中,AKR1C1的本底表达水平可能会影响外源性转入或者敲除AKR1C1的效率,我们首先采用Western Blot技术考察了 7株非小细胞肺癌细胞株和1株正常肺上皮细胞株的AKR1C1的本底表达水平。Western Blot结果表明SK-MES-1,A549,NCI-H460,PC-9细胞株的本底AKR1C1表达较高,NCI-H1299细胞株的本底AKR1C1表达中等,NCI-H1650细胞株的本底AKR1C1蛋白几乎不表达,正常肺上皮细胞株BES-2A的AKR1C1蛋白也几乎不表达。4、AKR1C1促进非小细胞肺癌细胞株的运动能力的增强Transwell和PCR的实验表明,过表达AKR1C1之后,非小细胞肺癌细胞株的运动能力增加,促转移相关蛋白(Fibronectin,N-cadherin)的mRNA水平增高;siRNA沉默AKR1C1之后,非小细胞肺癌细胞株的运动能力就减少,促转移相关蛋白(Slug,N-cadherin)的mRNA水平降低。5、在非小细胞肺癌细胞株中,AKR1C1通过与STAT3的结合而发挥促转移的活性免疫荧光结果显示,在IL-6的刺激下,AKR1C1由胞浆进入到核内,发生了核转位的过程,这就为AKR1C1与转录因子STAT3的结合提供了空间上的可能性。进一步的免疫共沉淀的结果提示AKR1C1可能与转录因子STAT3发生结合。6、在非小细胞肺癌细胞株中,AKR1C1与STAT3的结合影响了 STAT3转录活性Western Blot、RT-PCR 结果显示,当 siRNA 沉默 AKR1C1 后,STAT3 的磷酸化水平也发生了下降,伴随着STAT3的靶基因的mRNA水平,蛋白水平也发生了下降。当质粒转染高表达AKR1C1后,STAT3靶基因的mRNA水平也发生了上调。同时,在IL-6处理的情况下,AKR1C1沉默组别的STAT3磷酸化水平明显低于对照组别。7、在非小细胞肺癌细胞株中,STAT3对于AKR1C1的促转移作用是必须的根据SRB的结果,我们采用亚细胞毒性浓度的STAT3抑制剂作用于肿瘤细胞,考察细胞运动能力的变化。Transwell实验结果,可以观察到,当用STAT3抑制剂处理之后,AKR1C1的本底表达高的NCI-H460细胞的运动能力能够被抑制;AKR1C1的本底表达较低的NCI-H1299细胞高表达了 AKR1C1之后,运动能力也能够被抑制。8、AKR1C1促进非小细胞肺癌细胞NCI-H1299的裸鼠体内转移小动物PET-CT的成像结果显示,稳定高表达AKR1C1的NCI-H1299细胞株造成的肺部放射性浓聚程度高于对照组。这就说明,在裸鼠的尾静脉注射模型中,AKR1C1可以促进非小细胞肺癌细胞NCI-H1299的转移。9、AKR1C1-STAT3信号轴的激活和非小细胞肺癌病人的临床风险高度相关Bioinformatica数据库的非小细胞肺癌病人临床样本信息分析说明,AKR1C1/STAT3信号通路的激活程度越高,病人的临床风险越大。结论:我们的研究发现,AKR1C1可以促进非小细胞肺癌细胞运动能力的增加。同时,我们还发现AKR1C1的促转移作用,是通过与STAT3的结合,影响STAT3的磷酸化水平而发挥促转移作用的。另外,数据库分析的结果显示,AKR1C1在非小细胞肺癌病人样本中是表达上调的;AKR1C1-STAT3信号通路的激活程度和非小细胞肺癌病人的临床风险相关。本研究发现了新的调控STAT3的分子通路,丰富了 STAT3这个重要转录因子的调控网络,为STAT3的研究提供了新的方向;揭示了肺癌转移的新的参与蛋白,为肺癌的治疗提供了潜在靶点和全新的干预策略。