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马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)对马铃薯的危害最大,可导致马铃薯退化,降低马铃薯产量,严重时减产可达80%以上,甚至绝产。解决这一问题的重要途径是培养脱毒种薯或种苗,而高效可靠的病毒检测手段是确保脱毒种薯或种苗无毒的前提和关键。因此,建立快速、灵敏、规范化的病毒检测体系成为马铃薯产业发展的必然趋势。检测试剂盒的出现极大推动了脱毒马铃薯生产的发展。由于具有稳定、快捷、易于操作等优点,很多试剂盒已成为马铃薯病毒检测中的重要工具。目前,国内应用的分子检测试剂盒主要是进口产品。本研究旨在开发供脱毒种苗生产单位使用的一步RT-PCR检测试剂盒。根据马铃薯Y病毒外壳蛋白(CP)基因序列设计合成了一对引物LIU-PVY1、LIU-PVY2,以带毒样品植物总RNA为模板,通过RT-PCR检测技术扩增得到340bp的目的条带,而健康对照无此目的条带,从而建立了PVY的常规RT-PCR检测技术。以此为基础,在同一个反应中同时加入反转录和PCR反应所需试剂,反应程序中包括反转录和PCR反应所需条件,建立了PVY的一步RT-PCR检测技术。反应体系的优化:确立了M-MLV浓度、r-Tag酶浓度、dNTP的质量与浓度、Mg2+浓度及PCR反应的退火温度、时间和循环次数等。本研究采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分析和比较了四对通用引物(引物NIE-PVY和PVYj来源于加拿大马铃薯中心,引物PVYSP是国内报道的引物,引物LIU-PVY由黑龙江省农科院设计),得到引物LIU-PVY和PVYSP的通用性和特异性较强。另外,试验采用了SDS提取法、Trizol提取法和蛋白酶K法抽提植物总RNA,测得的OD260OD280值均大于1.70,大小顺序为:Trizol法>蛋白酶K法>SDS法。将三种方法提取的RNA进行凝胶电泳和RT-PCR产物的电泳分析表明,Trizol法提取的RNA完整性较好,纯度较高。再加之Trizol法简捷易行,节省时间等优点,选择Trizol法提取植物总RNA,并将其作为试剂盒中植物总RNA的提取方法。根据上述的研究结果,设计并组装了马铃薯Y病毒的一步RT-PCR检测试剂盒。针对通用性、灵敏度和特异性等方面对试剂盒进行验证,该试剂盒具有良好的稳定性和特异性,灵敏度可以检测到带毒植物组织下限的6.25μg,高于ELISA(0.1～10ng/mL)和NASH(15μg左右)的灵敏度,虽然和常规方法的灵敏度相同,但更为快速、简便、易于操作,适合脱毒种苗和种薯生产单位做大量样品的检测。黑龙江省PVYO系、PVYN系和PVYC系的发生情况调查表明:在总体上,PVYO的检出率为83.24℅;PVYN的检出率为73.41℅;PVYC为0℅。PVYO检出率高出PVYN 9.83个百分点,PVYN和PVYO的复合侵染率为56.65℅。利用引物SP3、SP4和SP5,以带毒样品植物总RNA为模板,通过RT-PCR检测技术PVYN样品扩增得到544bp的目的条带,PVYO样品扩增得到672bp的目的条带,而健康对照无此目的条带,从而建立了PVY株系的RT-PCR检测技术。