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一、研究背景长期以来，临床上的骨缺损修复，特别是大段骨缺损的修复，一直是外科医生面临的难题之一。用于骨缺损修复的材料主要有自体骨、同种异体骨及人工骨三类。其中同种异体骨由于其成骨性能及力学性能优于人工骨，而来源也不像自体骨那样受到限制，因而成为临床上应用最为广泛的骨修复材料。同种异体骨的临床应用一直受到其免疫原性及疾病传播风险的制约。早些时候人们曾尝试着用柳硫汞等化学方法的处理来降低异体骨的免疫原性和对其进行灭菌，但效果不佳。随着制备工艺的改进，人们逐渐倾向于用深低温冷冻法、冷冻干燥法及γ射线辐照来降低异体骨的免疫原性，其中γ射线辐照更兼具强大的灭菌功效。经过世界各国骨库几十年来的实践证明，上述方法能够很好地降低异体骨的免疫原性并有效地降低了因骨移植所致的疾病传播的风险，因而是目前最为常用的同种异体骨的制备方法。然而严格地讲，上述方法并不能完全消除同种异体骨的免疫原性，而经过上述方法处理后，同种异体骨的成骨性能及生物力学性能受到了明显的损害。致使目前为止临床上应用异体骨修复骨缺损的效果，特别是修复大段骨缺损的效果仍不能够令人满意。鉴于此，我们与许多研究者一样，希望对同种异体骨的制备方法进行新的探索。具体而言，就是在制备同种异体骨的过程中复合环孢菌素，通过在局部发挥环孢菌素强大的免疫抑制作用来代替深低温冷冻、冷冻干燥及γ射线辐照的降免疫原性作用，并用低温等离子体技术来代替γ射线辐照对异体骨进行灭菌，以期更好地抑制异体骨移植的免疫排斥反应，同时减轻制备过程中对异体骨成骨性能及力学性能的损害。另外，我们希望通过环孢菌素的局部应用来降低其药物副反应。二、研究目的初步验证复合环孢菌素并等离子体灭菌这一新的异体骨制备方法与深低温冷冻、冷冻干燥及γ射线辐照等方法相比，在抑制免疫排斥，促进骨愈合以及降低力学性能损害等方面的可行性甚至优越性。同时初步验证该方法的安全性。三、实验方法将新西兰兔分为实验、对照及空白三组并制备兔桡骨中段段缺损模型。实验组植入复合环孢菌素的同种异体骨，对照组植入深低温冷冻／冷冻干燥辐照异体骨，空白组旷置。并分别在不同时间点于各组之间进行免疫学评价(包括手术局部状况的比较，外周血淋巴细胞亚群分析及CD25分子密度的比较)，成骨性能评价（包括X线评分及组织学量化分析），以及生物力学评价（四点弯曲试验）。为了初步验证新方法的安全性，我们进行了体外细胞毒性及体内药物副反应等方面的比较。四、主要实验结果（一）免疫学评价1．手术局部状况的比较材料植入术后实验组及对照组动物的手术切口均一期愈合，伤口局部无红肿、渗液及化脓等情况出现。2．外周血淋巴细胞亚群分析实验组与对照组CD4+T淋巴细胞百分数在不同时间点之间有显著性差异（F=11.980，P＜0.001）；实验组各时间点之间无显著性差异（F=2.941，P=0.067），而对照组各时间点之间差异显著（F=23.425，P＜0.001）。对照组在术后1周及4周持续下降，而到了术后16周却显著反弹达到峰值。两组CD4+T淋巴细胞百分数无显著性差异（F=0.984，P=0.345）；从各时间点看，术前1天及术后1周两组无显著性差异，P值分别为0.248及0.702，术后4周实验组显著高于对照组（t=6.906，P＜0.001），术后16周对照组显著高于实验组（t=-3.583，P=0.003）。实验组与对照组CD8+T淋巴细胞百分数在不同时间点之间有显著性差异（F=4.586，P=0.009）；实验组各时间点之间无显著性差异（F=.860，P=0.180），对照组各时间点之间有显著性差异（F=3.733，P=0.035）。对照组从术前1天到术后4周呈下降趋势，而到术后16周又略有上升。两组CD8+T淋巴细胞百分数无显著性差异（F=3.658，P=0.085）；从各时间点看，除了术后4周实验组显著高于对照组（t=2.413，P=0.033）外，其余时间点两组均无显著性差异（P＞0.05）。实验组与对照组CD4+T／CD8+T比值在不同时间点之间无显著性差异（F=2.397，P=0.130）；实验组各时间点之间无显著性差异（F=0.960，P=0.437），对照组各时间点之间亦无显著性差异（F=4.402，P=0.076）。两组CD4+T／CD8+T比值无显著差异（F=1.944，P=0.193）；从各时间点看，除了术后16周对照组显著高于实验组（t=-2.533，P=0.030）外，其余时间点两组均无显著性差异（P＞0.05）。3．CD25分子密度的比较对实验组与对照组骨缺损局部行CD25分子免疫组化染色可见，术后1周及4周两组局部阳性物质密度大体相当，而术后16周，对照组局部的阳性物质密度明显高于实验组。（二）成骨性能评价1．X线评分实验组与对照组不同时间点的X线评分结果之间有显著性差异（F=386.159，P＜0.001）；在实验组和对照组均如此，F值分别为211.000和175.689，均为P＜0.001。实验组和对照组在术后1周分值最低，然后在后两个时间点均呈上升趋势。实验组分值显著高于对照组（F=5.671，P=0.032）；从各时间点看，术后1周和术后4周两组无显著性差异（P值分别为0.475和0.052），而在术后16周，实验组评分显著高于对照组（t=4.056，P=0.001）。2．组织学评价及量化分析术后1周对照组植入材料内有大量的有核细胞浸润，仍可见大量坏死物质及残存的骨小梁。实验组可见大量的新骨或类骨样物质生成，而材料内仍有大量的坏死物质未被清除。术后4周实验组植骨材料内新骨生成的范围明显大于对照组，坏死组织也明显减少，但正常骨组织的板层状结构并不明显。术后16周对照组植入材料内已有大量的新骨生成，骨陷窝明显可见，细胞团块中可见脂滴形成，提示有部分髓腔再通，周围的坏死物质也已被基本清除，但新生骨并未形成成片的板层状结构，骨组织内仅有少量血管。实验组植入材料内可见成片的板层状骨，且大部分骨质已成熟，可见大量的血管生成及骨陷窝，周围无坏死物质残留，髓腔内细胞团块中有脂滴形成，提示髓腔再通。实验组与对照组植骨近端新骨生成面积在不同时间点之间有显著性差异（F=28.237，P＜0.001）；在实验组和对照组均如此，F值分别为14.081和15.445，P值分别为0.010和0.001。实验组和对照组在术后1周新骨生成面积值最低，然后在后两个时间点均呈上升趋势。实验组新骨生成面积值显著高于对照组（F=89.023，P＜0.001）；从各时间点看，实验组的新骨生成面积值均显著高于对照组（P＜0.05）。实验组与对照组植骨远端新骨生成面积在不同时间点之间有显著性差异（F=33.009，P＜0.001）；在实验组和对照组均如此，F值分别为24.401和15.515，P值分别为0.000和0.001。实验组和对照组在术后1周新骨生成面积值最低，然后在后两个时间点均呈上升趋势。实验组新骨生成面积值显著高于对照组（F=27.864，P＜0.001）；从各时间点看，除术后16周两组无显著差异（t=1.715，P=0.146）外，其余各时间点的新骨生成面积值均以实验组为高（P＜0.05）。实验组与对照组植骨中央新骨生成面积在不同时间点之间有显著性差异（F=20.769，P＜0.001）；在实验组和对照组均如此，F值分别为35.887和7.981，均为P＜0.01。实验组和对照组在术后1周新骨生成面积值最低，然后在后两个时间点均呈上升趋势。实验组新骨生成面积值显著高于对照组（F=43.922，P＜0.001）；从各时间点看，新骨生成面积值均以实验组为高（P＜0.05）。（三）生物力学评价四点弯曲试验结果提示，实验组标本的极限弯曲负荷显著高于对照组（t=-2.257，P=0.048）。（四）安全性评价1．体外细胞毒性培养7天后光镜下可见骨髓间充质细胞在材料周围生长旺盛，形态良好；扫描电镜下可见细胞伸展良好，与材料表面贴附紧密。细胞表面大量的分泌颗粒提示细胞的分泌功能旺盛。各浓度组骨髓间充质细胞的OD值在不同时间点之间有显著性差异（F=21.714，P=0.001）；除了浓度Ⅵ组（F=1.080，P=0.417）外，其余各组均如此（浓度Ⅰ组：F=21.808，P＜0.001；浓度Ⅱ组：F=7.057，P=0.006；浓度Ⅲ组：F=10.109，P=0.002；浓度Ⅳ组：F=14.262，P＜0.001；浓度Ⅴ组：F=87.650，P＜0.001；空白对照组：F=419.880，P＜0.001；75％乙醇对照组：F=1157.776，P＜0.001）。不同浓度组的OD值之间具有显著性差异（F=278.126，P＜0.001）；从各时间点看，除了培养第1天（F=1.595，P=0.207）外，其余各时间点上不同浓度组之间的OD值均有显著性差异（第3天：F=27.558，P＜0.001；第5天：F=177.827，P＜0.001；第7天：F=24.401，P＜0.001；第9天：F=6.961，P=0.001）。从不同浓度环孢菌素下骨髓间充质细胞的生长曲线可见，局部添加的高浓度环孢菌素对细胞的生长具有明显的抑制作用。总体而言，随着环孢菌素药物浓度的增加，对细胞增殖生长的抑制作用就越明显。然而最高浓度组的细胞生长曲线（5mg／ml组），既不同于低浓度组（空白对照组，乙醇对照组，0.05／μg／ml组及0.5μg／ml），也不同于较高浓度组（5μg／ml组，50μg／ml组及500μg／ml组）。该曲线所反映的细胞增殖趋势介于上述两组之间。浓度Ⅵ组在不同时间点与其它各组比较的P值在一定程度上也支持这样一个结果。在细胞培养的第3天，除与浓度Ⅱ组比较外（P=0.063），与其它各组比较的P值均＜0.05；而在第5、7天，浓度Ⅵ组与其它各组比较的P值均＜0.05。2．体内药物副反应各组动物在整个观察期间均未见明显的躁动、震颤、呕吐、腹泻及齿龈增生等症状或体征。术后7天，实验组与对照组动物的肝脏与肾脏经组织学证明均为正常组织，两组的组织学表现无明显差异。实验组与对照组血清谷丙转氨酶的浓度在不同时间点之间无显著性差异（F=3.019，P=0.057）；在实验组和对照组均如此，F值分别为1.907和1.179，P值分别为0.199和0.371。实验组与对照组无显著性差异（F=0.025，P=0.880）；从各时间点看，实验组与对照组均无显著性差异（P值分别为0.808，0.721，0.608和0.913）。实验组与对照组血清肌酐的浓度在不同时间点之间有显著性差异（F=7.092，P=0.002）；实验组不同时间点的浓度之间无显著性差异（F=6.305，P=0.083），对照组不同时间点的浓度之间亦无显著性差异（F=1.740，P=0.228）。实验组与对照组之间无显著性差异（F=0.117，P=0.744）；从各时间点看，实验组与对照组之间均无显著性差异（P值分别为0.725，0.811，0.695和0.320）。五、实验结论在同种异体骨上复合环孢菌素并等离子体灭菌，可以有效地抑制同种异体骨移植的免疫排斥反应，并在促进成骨，减轻力学性能损害等方面优于深低温冷冻、冷冻干燥及γ射线辐照，而且可以避免长期全身应用环孢菌素所带来的副反应。