论文部分内容阅读
microRNA(miRNA)是一类长18~23个核苷酸的非编码RNA,在生长、发育、病毒复制、线粒体损伤和细胞凋亡等很多生物学过程中发挥重要作用。猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染PK-15细胞导致线粒体损伤,并通过死亡受体通路和线粒体通路诱导PK-15细胞凋亡,然而,在TGEV感染PK-15细胞过程中miRNA是否参与了调控TGEV复制、线粒体损伤和细胞凋亡,目前尚不清楚。本论文拟用TGEV感染PK-15细胞,检测TGEV感染后细胞miRNA表达谱的变化,筛选差异表达较大的miRNA,鉴定miRNA的靶基因,研究mi RNA及靶基因对TGEV复制、线粒体损伤和细胞凋亡的作用。研究取得如下结果。1.TGEV感染对miRNA表达谱的影响。利用miRNA芯片检测TGEV感染PK-15细胞后miRNA表达谱的变化,得到21个差异表达显著的miRNA(fold change>1.5,p<0.01),其中13个miRNA表达量上调,8个miRNA表达量下调。Real-time PCR验证这21个miRNA表达量变化,验证发现与miRNA芯片检测结果一致。采用TargetScan和miRanda算法预测21个差异表达miRNA的靶基因,得到7 844个靶基因。对预测到的靶基因进行GO和KEGG注释和聚类分析,发现靶基因参与了Toll样受体、RIG-I样受体和MAPK等信号通路,以及蛋白结合、锌离子结合、蛋白质磷酸化和蛋白激酶活性等生物学过程。2.miR-4331抑制TGEV gene 7转录。将miR-4331 mimics或inhibtors(各自相对应的control)分别转染PK-15细胞,再用TGEV感染细胞,real-time PCR检测miR-4331对TGEV转录的影响,结果发现,miR-4331抑制TGEV gene 7的转录(p<0.01),对TGEV基因组和其他亚基因组的转录没有影响(p>0.05)。筛选与病毒转录相关的16个靶基因,构建含靶基因3′UTR的重组双荧光素酶质粒,检测miR-4331与靶基因3′UTR的结合活性,结果发现,过表达miR-4331后只有含CDCA7 3′UTR重组质粒的细胞双荧光素酶活性显著降低(p<0.01)。将miR-4331 mimics或mimics control转染至PK-15细胞,western blotting检测结果发现,过表达miR-4331后CDCA7蛋白水平明显降低。设计合成CDCA7的siRNA,构建重组CDCA7真核表达质粒,将CDCA7的siRNA或重组CDCA7真核表达质粒转染至PK-15细胞,检测TGEV gene 7转录水平,结果发现,过表达CDCA7抑制TGEV gene 7的转录(p<0.01),抑制CDCA7表达则促进TGEV gene7转录(p<0.01)。3.miR-27b抑制TGEV诱导的细胞凋亡。将miR-27b mimics或inhibtors(及其相对应的control)分别转染PK-15细胞,再用TGEV感染细胞,检测细胞凋亡率、caspase-3、caspase-9和caspase-8活性。结果发现,miR-27b mimics(过表达miR-27b)显著抑制PK-15细胞凋亡率(p<0.05)、caspase-3(p<0.05)和caspase-9活性(p<0.05),对caspase-8活性没有影响(p>0.05);miR-27 inhibitors(抑制miR-27b表达)增加TGEV诱导的细胞凋亡率(p<0.05)、caspase-3(p<0.05)和caspase-9的活性(p<0.05),对caspase-8没有影响(p>0.05)。筛选与细胞凋亡相关的10个靶基因,构建含靶基因3′UTR的重组双荧光素酶质粒,检测miR-27b与靶基因3′UTR的结合活性,发现只有miR-27b mimics显著降低RUNX1重组质粒的海肾荧光素酶表达(p<0.01)。western blotting检测发现miR-27b mimics明显降低RUNX1蛋白水平。设计合成RUNX1的siRNA,构建重组RUNX1真核表达质粒,检测在TGEV感染PK-15细胞过程中,RUNX1对线粒体通路的调控作用。过表达RUNX1可以促进Bax的表达,增加caspase-9(p<0.05)和caspase-3的活性(p<0.05),siRNA干扰RUNX1的表达导致Bax表达量下调,抑制caspase-9(p<0.05)和caspase-3的活性(p<0.05)。4.miR-222抑制TGEV诱导细胞线粒体损伤。将mi R-222 mimics或者mimics control转染至PK-15细胞,然后感染TGEV,利用JC1和Rhod-2分别检测线粒体膜电位和钙离子浓度的变化,结果发现,过表达miR-222则线粒体膜电位增加了1倍(p<0.01)、钙离子浓度降低了38%(p<0.01)。iTRAQ检测miR-222过表达后TGEV感染PK-15细胞中蛋白表达谱变化,发现100个差异表达蛋白(蛋白量大于1.2倍或小于0.83倍为差异表达),其中57个蛋白表达量上调,43个蛋白表达量下调。构建9个含靶基因3′UTR的重组双荧光素酶质粒,检测miR-222与靶基因3′UTR的结合活性,发现只有miR-222mimics显著降低THBS1重组质粒的海肾荧光素酶活性(p<0.01)。western blotting检测发现miR-222 mimics明显降低THBS1蛋白水平。检测在TGEV感染PK-15细胞过程中,THBS1 siRNA对线粒体损伤的调控作用。干扰THBS1表达(THBS1 siRNA)线粒体膜电位增加了1倍(p<0.01),钙离子浓度降低了60%(p<0.01)。本研究发现TGEV诱导PK-15细胞mi RNA表达谱发生了改变,进一步研究差异表达的miRNA在TGEV感染PK-15细胞中的作用,发现miR-4331抑制TGEV gene 7转录,miR-27b抑制TGEV诱导的细胞凋亡,miR-222抑制TGEV诱导细胞线粒体损伤。研究结果阐明了差异表达的miRNA在TGEV感染PK-15细胞过程中的作用与调控机制,为进一步研究miRNA与TGEV的相互作用提供理论依据。