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急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心血管疾病致残和致死的首要原因。梗死局部缺血缺氧可以导致心肌细胞凋亡坏死、心肌瘢痕形成、心室重构,最终导致心力衰竭的发生。因此,如何使受损的心肌在数量及功能上得到补偿,一直是AMI基础和临床研究的热门课题。尽管药物治疗、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉搭桥术等治疗措施已经取得了很大的进步,但仍存在许多不足。近年来,心肌内自体多向分化潜能细胞移植,进而替代、修复受损的心肌组织,使受损的心肌在数量及功能上得到补偿,为AMI的治疗带来了新的曙光。目前已有多种来源和类型的细胞用于移植治疗。其中,骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)取材方便,具有高度自我更新和多向分化潜能、并能促进血管新生,已成为细胞治疗中较为理想的组织替代细胞,在AMI细胞治疗中显示了良好的应用前景。有研究显示,年龄因素显著影响干细胞的功能,是影响疾病发生发展的重要原因之一。故我们推测,年龄可能是影响骨髓干细胞AMI后修复效果的重要因素之一。因此,我们建立年轻、年老骨髓干细胞AMI修复模型,观察年轻、年老骨髓干细胞对AMI后心肌修复效果的影响,并探讨其可能机制。
方法:
一、不同年龄小鼠骨髓干细胞重建模型的建立
分离年轻(4～6周龄)和年老(10～13月龄)雄性小鼠BMSCs,通过尾静脉注射到年老(10～13月龄)雌性小鼠(在移植前0.5h辐照10.5Gy致死性剂量)体内,观察移植6周后受体小鼠存活情况和PCR检测受体小鼠心脏内供体特异性Y染色体。
实验分为两组：接受年轻雄性小鼠骨髓干细胞移植的年老雌性小鼠为yo组；接受年老雄性小鼠骨髓干细胞移植的年老雌性小鼠为oo组。
二、年龄对骨髓干细胞修复AMI效果的影响及机制
1.年龄对骨髓干细胞修复AMI效果的影响
AMI模型的建立：小鼠骨髓重建后6周,通过结扎冠状动脉左前降支,建立AMI模型。实验分为yo组和oo组,分别检测以下指标：
1)利用超声心动图及压力.容积导管术检测yo和oo组小鼠AMI前、后(第3、7、14、28天)心脏功能；
2).AMI后第28天测量yo和oo组梗死面积和厚度；
3).AMI后第28天经α-SMA免疫染色观察yo和oo组梗死边缘区小动脉密度；
4)AMI后第3天通过Ki67免疫染色测定yo和oo组细胞在心肌损伤后的增殖效应。
2.年龄影响骨髓干细胞修复AMI效果的机制研究
实验分为四组：接受年轻雄性小鼠骨髓干细胞移植的年老雌性小鼠为yo组；接受年老雄性小鼠骨髓干细胞移植的年老雌性小鼠为oo组；年轻雄性小鼠为y组；年老雄性小鼠为o组。分别检测以下指标：
1)年轻、年老骨髓干细胞重建小鼠生存率；
2)计数y、yo、o、oo组骨髓干细胞集落形成单位(CFU)的基数值,以此反映AMI前骨髓干细胞的分化潜能；
3)通过LDL和lectin染色观察y、yo、o、oo组骨髓和脾内皮祖细胞(EPC)数目,以此反映AMI前EPC的储备能力；
4)用流式细胞仪检测y、yo、o、oo组外周血、骨髓和脾CD34+/c-kit+和CD34+/KDR+细胞数目,以此反映AMI前骨髓干细胞和EPC动员能力；
5)AMI前用PCR测定比较yo和oo组心脏内Y染色体数量；AMI前、后(第3、7、14、28天),用real-time PCR测定y、yo、o、oo四组的Y染色体数量。
结果:
一、年轻、年老小鼠骨髓干细胞重建模型的建立
接受年轻和年老来源BMSCs的小鼠在移植6周后均大部分存活,且在心脏细胞均能检测到供体特异性Y染色体,提示成功建立不同年龄小鼠骨髓干细胞重建模型。
二、年龄对骨髓干细胞修复AMI效果的影响及机制
1.年龄对骨髓干细胞修复AMI效果的影响
1)AMI前及AMI后第3天,两组间小鼠左室短轴缩短分数(FS)和左室短轴面积变化分数(FAC)无明显差异。但术后第7、14、28天,yo组的FS和FAC均优于oo组,差异有统计学意义,P<0.05。yo组FS和FAC下降趋势较oo组放缓,差异有统计学意义,P<0.01;
2)AMI后第28天,测定收缩功能(收缩末容积、射血分数、dP/dt max等)和舒张功能(舒张末容积、dP/dt min、Tau_w等),以及心输出量、每搏功、每搏输出量,yo组均优于oo组,两组间差异有统计学意义,P<0.05;
3)AMI后第28天,yo组的左室梗死面积百分比(39.85％±4.31％)较oo组(50.24％±4.32％)小,而梗死壁厚度(0.442mm±0.087mm)大于oo组(0.288mm±0.050mm),差异均有统计学意义,P<0.01;
4)AMI后第28天观察梗死边缘区,yo组α-SMA染色阳性小动脉数(6.50±1.29)较oo组(2.00±0.82)多,差异显著,P<0.01;
5)AMI后第3天收集心脏标本做免疫染色,观察梗死边缘区ki67+细胞数。可见yo组ki67+细胞数(15.00±1.83)明显较oo组(8.00±1.83)多,P<0.01。
2.年龄影响骨髓干细胞修复AMI效果的机制
1)以尾静脉注射骨髓干细胞当天为起始观察点,连续观察6周,00组存活率(47/60,78.3％)低于yo组(57/60,95％),差异有统计学意义,P<0.05;
2)AMI前,Y和yo组、o和oo组骨髓干细胞向造血干细胞(BFU-e、CFU-GM、CFU-GEMM)和间充质干细胞(CFU-F)系增殖分化能力相似；yo组和oo组相比,增殖分化能力明显增强,其BFU-e、CFU-GM、CFU-GEMM、CFU-F克隆形成数量分别为(35.83±4.96)vs.(19.67±4.84)、(93.00±7.10)vs.(73.83±8.3)、(8.13±1.41)vs.(1.63±1.03)、(22.00±2.10)vs.(12.50±1.64),差异均有统计学意义,P<0.01;
3)AMI前,骨髓和脾细胞培养后2天用LDL和lectin染色,y和yo组、o和oo组间EPC储备能力类似。yo组和oo组相比,EPC数量增多,其在骨髓和脾的数目分别为(14.89±3.69)vs.(15.89±7.18)、(6.56±2.35)vs.(4.67±1.22),差异均有统计学意义,P<0.01;
4)AMI前,骨髓、外周血和脾内,yo和Y组、oo和o组间CD34+/c-kit+和CD34+/KDR+细胞百分比类似。外周血中yo组CD34+/c-kit+和CD34+/KDR+阳性细胞数的百分比都比oo组增多,百分比分别为(1.49±0.43)％vs.(0.94±0.25)％、(1.02±0.29)％vs.(0.64±0.25)％,P<0.05,有统计学差异,而骨髓和脾,各组间CD34+/c-kit+和CD34+7KDR+阳性细胞数无统计学差异；
5)AMI前oo组心脏内Y染色体数量明显较yo组少；yo组Y6/GAPDH值(0.25±0.05)较oo组(0.12±0.02)增加一倍以上,P<0.01;
6)AMI前及AMI后第3、7、14、28天,观察受体小鼠骨髓细胞、外周血细胞和心脏中Y染色体数量,yo组均高于oo组,差异有统计学意义,P<0.01;以AMI前含Y染色体的细胞作为观察基点,yo和oo组骨髓细胞Y染色体数量在AMI后均随时间呈明显下降趋势,有统计学差异,P<0.05;yo和oo组外周血细胞均在AMI后第3天明显升高,P<0.05,第14天,较第3天略有下降,但与观察基点相比无统计学差异,到第28天,继续下降,与观察基点相比,有统计学差异,P<0.05;而心脏中Y染色体数量在AMI后第3天,yo组明显升高,P<0.05,但oo组升高不明显,无统计意义。第14、28天,yo和oo组数量随时间持续下降,与观察基点相比,有统计学差异,P<0.05。
结论:
1.年龄是影响急性心肌梗死后骨髓干细胞修复效果的重要因素。与年老骨髓干细胞相比,年轻骨髓干细胞能够更多的预先定植心脏,梗死后能更好的改善心功能,减小梗死面积,促进心肌修复和血管形成。
2.急性心肌梗死后不同年龄骨髓干细胞的修复效果差异与年龄对骨髓干细胞功能的影响有关,年轻骨髓干细胞有更好的移植存活率、细胞分化潜能和EPC动员能力。