论文部分内容阅读
目的：本课题在既往研究的基础上,构建小鼠C-X-C型趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4, Cxcr4)基因的慢病毒过表达载体,经体外转染小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs),并与免疫磁珠法分选获得小鼠造血干细胞(Hematopoietic stem cell, HSCs)共移植,重建小鼠骨髓嵌合体模型,探讨过表达CXCR4对MSCs归巢的影响,以及对整个小鼠骨髓造血系统恢复的影响。成功造模后,构建嵌合体小鼠Lewis肺癌模型,联合金复康口服给药,探讨过表达CXCR4-MSCs后,肿瘤组织、瘤周组织淋巴管形成情况及肿瘤生长情况,明确金复康基于过表达CXCR4调控淋巴管新生以达到抗肿瘤作用。方法：(1)观察小鼠骨髓间充质干细胞在体外不同培养条件下的生长情况,每日细胞计数绘制其生长曲线,MTT法测其OD值,流式细胞术检测其纯度。(2)CD117+免疫磁珠法分选小鼠骨髓造血干细胞,流式细胞术检测其分选效率。(3)摸索慢病毒过表达CXCR4转染MSCs的最佳MOI值,流式细胞术检测其转染效率。(4)以C57BL/6小鼠雄鼠为供体,雌鼠为受体,建立同基因小鼠骨髓嵌合体模型,受鼠接受TBI(总剂量为8Gy,2Gy/min,视野30×30cm)后随机分为5组：过表达CXCR4-MSCs+金复康组、过表达CXCR4-MSCs+环磷酰胺组、过表达CXCR4-MSCs+生理盐水组、过表达空载-MSCs+金复康组、过表达空载-MSCs+生理盐水组。造模成功后,进行外周血、骨髓涂片,激光共聚焦显微镜下观察红色荧光表达情况,过表达CXCR4对MSCs归巢的影响；同时检测外周血白细胞、红细胞、血小板的恢复情况,观察其对小鼠骨髓造血系统恢复的影响。(5)小鼠骨髓嵌合体模型造模成功35天后,于右腋皮下注射Lewis肺癌细胞(1×107/ml/只),构建嵌合体小鼠Lewis肺癌模型,1周后行金复康灌胃注射(0.4ml/只,相当于给药量60g/kg/d),环磷酰胺腹腔注射(20mg/kg/只),生理盐水灌胃注射(0.4m1/只)。28天后全部处死小鼠,取出肿瘤组织称重、冰冻切片、免疫荧光染色,淋巴管内皮经LYVE-1抗体标记为绿色,DAPI标记细胞核为蓝色,观察过表达CXCR4后新生淋巴管中红色荧光、绿色荧光及Merge后的荧光表达情况；观察应用金复康后,肿瘤组织的生长及变化情况。结果：(1)利用全骨髓培养法可成功获取高纯度的小鼠骨髓MSCs,通过对P3代骨髓MSCs流式鉴定后发现：10%FBS+DMEM/F12完全培养基培养条件较适宜骨髓MSCs的体外培养,其阳性率分别为CD90.2=42.7%, CD105= 98.2%。优于10%FBS+DMEM组(CD90.2=19.8%, CD 105=95%)和15%FBS+DMEM组(CD90.2=21.3%, CD105=95.7%)。(2)CD117+免疫磁珠法能成功分选出高纯度的小鼠骨髓HSCs,流式鉴定结果显示,与未分选前相比(阳性率1.1%),利用MACS分选后,可显著提高其分选效率(阳性率54.5%)。(3)成功将慢病毒过表达CXCR4转染了P3代MSCs,确定了转染的最佳MOI为40,流式检测其MSCs上CXCR4含量,与慢病毒NC-MSCs组相比(阳性率12.5%),慢病毒LV-CXCR4-MSCs后,获得了高转染效率(阳性率71.5%)。(4)成功构建了小鼠骨髓嵌合体模型,通过对其外周血、骨髓涂片后发现,激光共聚焦显微镜下观察到骨髓间充质干细胞分化、迁移而来的红色荧光细胞,且与未过表达组相比,过表达组红色荧光含量明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)慢病毒过表达CXCR4后,小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板恢复明显增快,与未过表达组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)嵌合体小鼠Lewis肺癌模型构建成功后,取出肿瘤称重统计后发现,慢病毒过表达CXCR4后,肿瘤组织均明显增大,与其他各组相比,差异均有显著统计学意义(P<0.01)；而口服应用金复康后肿瘤组织均明显小于未口服金复康组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)慢病毒过表达CXCR4后,新生淋巴管中红色荧光表达明显增多,其中部分新生淋巴管组织可表现为RFP/LYVE-1(GFP)双阳性。通过计算平均标准转化率后发现,过表达各组中平均标准转化率明显高于其他各组(P<0.05),而口服金复康后,金复康组中平均标准转化率显著低于过表达组(P<0.05)。结论：(1)体外成功培养出高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并于免疫磁珠法分选获得的造血干细胞共移植后,成功构建了小鼠骨髓嵌合体模型。(2)慢病毒过表达CXCR4-MSCs后,可促进MSCs的归巢、同时促进了嵌合体小鼠骨髓造血系统的恢复。(3)慢病毒过表达CXCR4-MSCs后促进了MSCs迁移至肺肿瘤组织且参与了肿瘤组织的淋巴管新生,同时促进了肿瘤组织的生长。(4)金复康口服液对Lewis肺肿瘤组织生长具有明显抑制作用,其机制可能是通过抑制骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞转化而达到抗肿瘤作用,而SDF-1/CXCR4可能是其通路之一。