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目的促进血管新生、改善微循环是治疗缺血性疾病如冠状动脉硬化性心脏病、脑血管疾病和周围动脉闭塞性疾病的关键。“治疗性血管生成”是目前新提出的概念，其与传统的药物、介入外科手术等治疗手段不同,是通过模拟体内血管生成机制来达到促进血管新生,改善侧支循环的目的。其中种子细胞来源是血管组织工程的瓶颈,而内皮细胞(endothelial cells, ECs)是组织工程化血管中急需解决的种子细胞之一。目前已有研究者从不同干细胞分化ECs,如胚胎干细胞、胚胎的成血管细胞、内皮前体细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)和多潜能成体干细胞[4],但这几种细胞系在体内含量很少,且受各种因素限制不易获得。2004年,Oswald等人首次成功在体外诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向血管内皮细胞分化,因此,MSCs可能成为分化为内皮细胞理想的种子细胞来源。但人骨髓中的MSCs含量极低,大约1×104-1×105个单核细胞中含有1个MSC,并且在严重感染、骨髓恶性肿瘤或随着年龄增长的情况下,骨髓MSCs数量及增殖、分化能力均明显下降。2004年,Fukuchi等从成熟胎盘小叶中获得MSCs,后来证明胎盘来源的MSCs(placenta derived mesenchymal stem cells, PDMSCs)具有和骨髓来源的MSCs相似的形态学、免疫表型和功能特点。我们实验室也证明PDMSCs具有向脂肪、软骨、骨和神经分化的潜能。胎盘作为产后“废弃物”,对其研究不涉及伦理道德问题,且来源丰富。目前国内外尚未见PDMSCs向血管内皮细胞分化。因此,本实验将体外分离培养获得的PDMSCs经VEGF和bFGF体外诱导向血管内皮细胞分化,并在诱导过程中的不同时间点检测内皮特异性抗原的表达变化和分化的ECs在体外形成血管的能力,为临床上应用PDMSCs移植治疗缺血性疾病和构建血管组织工程提供实验依据。方法1、PDMSCs的分离、纯化和扩增采用组织块种植法提取原代,无菌条件下剪碎胎盘组织,然后均匀接种至10cm培养皿,加含10%FBS的DMEM1Oml,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,每3d换液一次,待细胞爬出生长至培养皿底部面积的70%-80%时去组织块传代,传2-3代,红细胞、成纤维细胞等混杂细胞即消失。本实验选取第3代PDMSCs进行诱导分化及检测。2、流式细胞仪分析收集第3代PDMSCs,细胞计数后取各管为1×106细胞,滴加PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD105、CD34和FITC标记的CD166、CD31、CD45 20ul,分别设PE、FITC、空白对照组,4℃避光孵育30 min,冰PBS洗涤1次,弃上清,加入200 ul PBS吹打混匀细胞,流式细胞仪检测。3、体外ECs诱导分化培养选择传代纯化后培养生长良好的第3代PDMSCs,调整细胞浓度为3×104cells/ml和1.5×1O5cells/ml分别接种于35mm培养皿和60mm培养皿中,加内皮细胞诱导分化培养基,置于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,每4d换一次新鲜诱导液。4、光镜下观察PDMSCs形态变化在光学倒置显微镜下观察PDMSCs诱导后形态学变化、增殖情况及排列方式,对比0d、4d、8d、12d的变化。隔天观察一次。5、免疫细胞化学染色以3×104cells/ml密度接种于35mm培养皿中,加诱导分化培养基培养,分别于分化第0d、4d、8d、12d用免疫细胞化学染色法检测内皮特异性标志CD31、CD144/VE-cadherin、KDR、vWF的蛋白表达情况。弃去培养基,PBS洗3遍4%多聚甲醛固定30min,滴加一抗,4℃孵育过夜,滴加二抗,37℃孵育30min。显微镜下观察拍照。6、透射电镜观察细胞超微结构诱导后的细胞用0.25%Trypsin-EDTA消化后,1%锇酸固定,O.lmol/L PBS漂洗三次,酒精、丙酮梯度脱水：30%酒精-50%酒精-70%酒精-80%丙酮-90%丙酮-100%丙酮。环氧树脂浸透、包埋,超薄切片70nm。JEM-1200EX镜下观察并拍照。7、体外血管生成实验用体外血管生成试剂盒,观察在半固体Matrix上诱导7d的细胞形成毛细血管样网状结构的能力。将Matrix置于4℃融化,24孔板每孔铺200ul ECMatrix,37℃、5%CO2的培养箱孵育2h,将诱导7d的PDMSCs以5×104/孔接种到半固体培养基上,2h后开始在倒置显微镜下观察细胞形成管状结构的形态。结果1、PDMSCs的原代培养结果胎盘组织块接种后,约7d-10d组织块周围可见梭形和小圆形两种贴壁细胞。随着细胞密度的增加,细胞逐渐变成梭形单层细胞,呈漩涡状排列,胞体变得大而扁平,形态类似于成纤维细胞。约14d-21d,细胞生长至70%-80%去组织块传代培养,传代细胞稳定生长。2、流式细胞仪检测第3代PDMSCs高表达MSCs的表面标志CD105(92.87%)和CD166(72.40%),不表达造血系统特异标志CD34和白细胞共同抗原CD45,也不表达内皮细胞特异的表面标志CD31。3、细胞形态学和排列方式观察在倒置和相差显微镜下观察,诱导分化的细胞形态呈鹅卵石样,且细胞排列具有一定方向性,呈管腔状、轮辐状、条带状生长,且细胞呈首尾相接连接在一起。4、免疫细胞化学染色结果(1)CD31在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,CD31在4d出现微量表达,但与Od相比无统计学意义(P＞0.05),随着细胞不断分化,于分化8d CD31表达显著增强,明显高于0d、4d、12d(P<0.05)，12d表达减弱。(2) VE-cadherin/CD144在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,CD144呈时间依赖性地表达于细胞与细胞之间的粘着小带,在诱导分化的Od和4d有微量表达,二者相比无统计学意义(P>0.05),于分化8d和12d,细胞与细胞之间CD144阳性染色的棕黄色颗粒出现逐渐增多的趋势。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的8d和12d,细胞的积分光密度值(IOD)与其他三组有显著的统计学差异(P<0.05)，表明CD144可作为内皮终末分化的标志来鉴定成熟阶段的内皮细胞。(3)vWF在ECs分化过程的表达变化在PDMSCs向ECs诱导分化的过程中,vWF在0d有微量表达,4d表达增强,8d达高峰,之后稳定表达。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的8d和12d,细胞的积分光密度值显著高于Od和4d(P<0.05)。(4) Flk-1/KDR在ECs分化过程的表达变化Flk-1作为内皮细胞的早期标志,在Od即有表达,4d表达最强,随后表达降低。图像分析表明,PDMSCs向ECs诱导分化的4d,细胞的积分光密度值显著高于0d、8d和12d(P<0.05),0d、8d和12d三组间无统计学意义(P>0.05)。5、PDMSCs诱导的ECs超微结构透射电镜下观察诱导8d的细胞,可以看见内皮细胞典型的细胞膜穴样凹陷和吞饮小泡,胞浆中可见内皮特异性结构Weibel-palade小体。此外,胞浆中可见较多线粒体、高尔基体、粗面内质网和溶酶体等细胞器,提示细胞增殖分化旺盛,核膜和核仁清晰可见。6、PDMSCs源的内皮细胞体外血管生成能力诱导7d的内皮细胞接种到细胞外基质凝胶(ECMatrigel)中,2h后相邻的细胞伸出触突彼此相连,并逐渐通过管状结构联成网状,5h-6h趋于典型,呈“毛细血管腔”样结构,而未分化的PDMSCs呈散在的细胞,不能形成管样结构。结论1、胎盘组织中可以分离出大量的PDMSCs。2、PDMSCs在体外可被诱导分化为血管内皮细胞,且分化的内皮细胞在体外具有迁移和血管形成能力。3、在PDMSCs向ECs分化过程中,内皮特异性标志Flk-1/KDR、CD31、vWF和VE-cadherin/CD144的表达高峰呈一定时间顺序性。