论文部分内容阅读
转基因动物在人类疾病研究、珍贵药物蛋白生产、培育新品种等方面发挥着重要的作用。优化转基因动物技术以提高转基因效率及遗传的稳定性、降低生产成本、简化技术操作等一直是转基因研究工作的重点。本实验探讨基于慢病毒载体(Lentiviral vector，LV)的精子介导转基因法(Sperm—mediated gene transfer，SMGT)的可行性，为高效制备转基因小鼠和犬提供有价值的参考。实验主要包括三个部分：
第一部分：曲细精管注射慢病毒载体的转基因方法研究
将8只4～5周龄的雄性昆明小鼠分为高(2只)、低剂量(6只)两个实验组，经由曲细精管注射滴度分别为1×109、2×107TU/mL的绿色荧光蛋白慢病毒载体(LV—GFP)，注射量均为20μL/testis。在注射后第4、8周分别处死高剂量组小鼠各1只、第5、15、17周分别处死2只低剂量组小鼠，取睾丸，PCR检测小鼠睾丸组织DNA和荧光镜检睾丸组织冰冻切片以评估GFP基因在睾丸组织中的整合与表达；低剂量组6只小鼠在注射后第2～9周与雌鼠交配生产F1仔鼠，PCR检测F1仔鼠鼠尾DNA。实验结果显示：1)GFP基因在小鼠睾丸组织DNA中的整合阳性率为62.5％；2)GFP表达弱，仅见于高剂量组小鼠睾丸，主要分布于曲细精管基膜及管间隙；3)F1小鼠的转基因阳性率为0％(0/341)；4)曲细精管注射法对小鼠睾丸组织造成了一定损伤，但并未影响小鼠生殖能力。说明基于慢病毒载体的曲细精管注射法可转染小鼠睾丸组织，GFP基因的表达与慢病毒滴度有关。
第二部分：睾丸内注射慢病毒载体法制备转基因犬的初步研究
为了直接观察慢病毒载体对大动物生殖细胞的感染，选用比格犬为实验对象，分为高中低剂量3个实验组。经由睾丸打点注射法，犬两侧睾丸分别注入滴度为5×108、1×108、2×107 TU/mL的慢病毒液，注射量为0.2mL/只犬。于注射后第2周开始采集精液，通过精液DNA的PCR检测和精子的荧光镜检评估GFP基因的整合及表达。结果显示：1)在高剂量组，整合并表达GFP基因的精子于第4周首现并持续至第17周；在中、低剂量组于第5周首现，分别持续到第14周、12周；2)绿色荧光蛋白表达的高峰期在注射后第7周～10周；3) GFP表达于整个精子，以顶体后区和颈部表达最强；4)注射后第2周～6周，中剂量组犬采精困难，高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势；5)在GFP表达的高峰期，绿色荧光精子的百分率在高中低剂量组分别为43.33％、35.53％、4.55％，具有明显的差异。说明基于慢病毒载体的SMGT法可成功获得转基因犬精子，转基因阳性率、表达的强度与持续时间与慢病毒滴度相关。
第三部分：犬精液的冷藏保存研究
探讨4℃保存的条件下，苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)对犬精子的保护作用。犬精液以含不同浓度PMSF的Tris—卵黄液(Tris—eggyolk，EYT)处理后，于4℃低温保存，在24、48、72、96h分别以伊红、瑞—吉和吖啶橙染色检测精子活率、顶体膜和DNA完整性。实验发现，低温保存24h后，吖啶橙染色检测DNA断裂率(％)：对照组：5.93±0.32，20μg/mL实验组：4.50±0.38、40μg/mL组：4.20±0.25、80μg/mL组：4.21±0.46、160μg/mL组：3.87±0.67，P<0.05；各浓度组之间没有明显差异；72h后，犬精子活率仍>30％；96h内，对照组和实验组犬精子在活率、项体膜完整性上未见明显差异。说明PMSF于4℃低温保存条件下对犬精子具有保护作用，24h内能有效保护精子DNA双链的完整性，4℃低温保存72h后，犬精子仍符合人工授精要求。