论文部分内容阅读
RNAi是一种真核生物中普遍存在、进化上高度保守的同源依赖型基因沉默现象，其基本原理是:长的dsRNA能激活细胞中RNaseⅢ家族Dicer(或DCL)的活性，被其切割成21-25bp的小干扰RNA(siRNA)，siRNA迅速与多蛋白复合体AGO-Piwi结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC以siRNA的反义链为向导，识别同源基因并使其发生转录或转录后水平的沉默。利用DNA重组技术，构建病菌基因发夹结构的RNA(hairpinRNA)（转录后均形成dsRNA）植物表达载体，转化植物，获取抗病菌转基因植物是利用基因工程技术控制植物病害的最有效策略。RNA介导的病菌抗性具有抗性强、抗性持久、生物安全性高等特点，并且RNAi信号可以在密切接触的物种间相互转移。 致病疫霉是一种卵菌，是一种爆发性病害，能引起马铃薯植株地上部分迅速死亡和块茎的腐烂。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大粮食作物，其种植面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米。致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.) de Bary)引起的晚疫病是马铃薯最具毁灭性的病害，其防治难度远超水稻稻瘟病和小麦锈病，是当前世界农业生产中危害最为严重的病害之一。该病原菌进化潜力极强，能迅速克服抗病品种的抗性基因，并能迅速对杀菌剂产生抗性。19世纪爱尔兰马铃薯大饥荒给人类留下了深深的烙印，鉴于晚疫病的发生和流行给马铃薯生产造成巨大损失，并严重威胁着世界农业生产及粮食安全，所以控制晚疫病的发生和流行对于稳定马铃薯产量、促进农业生产和保障世界粮食安全意义重大。 纤维素是细胞壁的重要组成成分，目前有关纤维素合成的研究主要集中在纤维素合酶(CesA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶(UGPase)。有研究表明，通过抑制纤维素合酶基因的表达可以有效降低马铃薯晚疫病的发病率。为探索植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因表达的有效性，开辟马铃薯抗晚疫病育种新途径，本研究采用重叠延伸PCR技术克隆了同时与晚疫病菌4个ces基因均同源的融合基因C1234，构建了内含子连接的C1234反向重复序列植物表达载体，转化晚疫病易感马铃薯品种大西洋，经PCR和Southern杂交检测，获得了129个转基因株系。通过接种病原菌后转基因马铃薯与野生型马铃薯侵染斑部位致病疫霉4个ces基因的表达水平分析，进一步阐明植物介导的RNAi抑制马铃薯晚疫病特定基因表达的有效性。本研究的开展将为马铃薯抗晚疫病育种提供新策略，同时为植物抗真核病原微生物胁迫和植物-病原菌互作研究提供新思路。本研究的主要实验结果如下: (1)利用重叠延伸PCR克隆了同时与晚疫病菌4个ces基因均同源的融合基因C1234，构建了内含子连接的C1234反向重复序列植物表达载体，成功转入农杆菌，用于后续马铃薯大西洋的遗传转化。 (2)马铃薯遗传转化最适培养基的筛选:抗生素Kan浓度设定为50 mg/L和Cef浓度设定为200mg/L，大西洋叶片愈伤组织最适再生培养的培养基为2.0mg/L6-BA+1.0mg/L ZT，大西洋叶片愈伤芽分化的激素组合为1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L ZT+0.01 mg/L GA3。 (3)转基因株系离体叶片接种病原菌后，有97个发病速度明显慢于野生型，在接种6d时病斑和霉层厚度明显小于对照，并且叶片感病部位没有出现失绿斑，而作为对照的野生型则产生了明显的失绿斑。通过实时定量RT-PCR分析发现，发病延缓的叶片上致病疫霉4个纤维素合酶基因的表达水平明显低于野生型。本研究表明转基因植株中产生的以晚疫病菌ces基因为靶标的dsRNA能够沉默致病疫霉相应基因表达，延缓发病进程。