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目的:研究D-半乳糖对SD大鼠椎间盘细胞衰老的影响;建立诱导大鼠椎间盘细胞衰老模型，研究椎间盘细胞衰老的病理机制，并进一步探讨补肾方及有效组分延缓椎间盘细胞衰老的作用规律研究;探讨其有效组分淫羊藿苷、补骨脂素及齐墩果酸对诱导大鼠椎间盘细胞衰老的调控作用。 方法: 1.SPF级10周龄雄性健康SD大鼠80只，体重为380±44.7g，随机分为:对照组、D-半乳糖诱导组、补肾方组、维生素E组。连续12周分别给予每日D-半乳糖腹腔注射和药物灌胃，对照组全部以生理盐水代替、D-半乳糖组灌胃以生理盐水代替。SPF级10月龄雄性SD大鼠20只，体重598±48.3g，自然成长12周后处死，作为老年组。取下腰部椎间盘，进行染色、免疫组化分析以及实时定量RT-PCR检测。对大鼠椎间盘组织形态学、蛋白以及基因的表达进行观察和检测，以评价大鼠椎间盘细胞衰老模型。 2.选择1月龄SPF级雄性健康SD大鼠，体视学镜下摘取髓核，在培养箱内贴壁生长后，选择补肾方有效组分干预D-半乳糖诱导髓核细胞衰老。比较中药有效组分黄芪甲苷和补肾方有效组分干预D-半乳糖诱导软骨细胞衰老的结果。细胞增殖实验和实时荧光定量PCR法进行药物浓度筛选，最终通过实时荧光定量PCR法检测、流式细胞技术、染色等方法评价各单体对D-半乳糖诱导软骨细胞衰老的影响。 3.C57小鼠进行腹腔10％水合氯醛麻醉处死后剪尾，皮肤酒精消毒，剥皮入PBS清洗3次。在体视学显微镜下，手术刀剥除椎旁韧带显露椎间盘，沿上下软骨终板完整的切下椎间盘，PBS清洗，将3D培养胶铺平60mm培养皿，将椎间盘快速种入胶内，待凝固后再加入10％FBS的DMEM培养液覆盖表面，放入培养箱内，每天换液一次，隔日拍照连续观察。经过中药有效组分干预后，利用流式细胞技术、染色、PCR分析结果。 结果: 1.病理形态学评分证明D-半乳糖诱导可以加速椎间盘退变，椎间盘髓核皱缩，椎间盘高度显著下降，纤维环排列松散、断裂。免疫组化染色结果显示D-半乳糖诱导模型组p16INK4a阳性染色数目显著增加，RB阳性染色数目显著减少，与D-半乳糖诱导模型组相比，盐水对照组、补肾方组及维生素E组可以下调椎间盘的软骨终板、纤维环及髓核部位p16INK4a表达，上调RB表达。PCR结果与免疫组化染色结果一致。D-半乳糖诱导细胞增殖能力下降，β-半乳糖苷酶活性染色模型组的阳性细胞数量明显增多。 2.椎间盘原代细胞的观察，镜下可见软骨终板来源的细胞呈梭形，染色鉴定CD24染色呈阴性，而髓核来源的细胞相比细胞体积小，而髓核细胞呈多角形，面积大，CD24染色呈阳性。D-半乳糖诱导髓核细胞模型组p16INK4a的mRNA表达显著增高、Cyclin D1mRNA表达显著降低，与D-半乳糖诱导模型组相比，对照组、补肾方组有效组分淫羊霍苷和齐墩果酸椎间盘的都可以降低p16INK4a的mRNA表达、增高Cyclin D1的mRNA表达。D-半乳糖诱导后，软骨细胞β-半乳糖苷酶活性染色阳性染色数目增加，超氧化物歧化酶SOD活性下降，ROS荧光活性增强，细胞凋亡率升高，中药有效组分黄芪甲苷可以对抗D-半乳糖诱导的结果。 3.空白组髓核细胞由于细胞饥饿，细胞总凋亡率升高。与D-半乳糖诱导组相比，补肾方有效组分淫羊霍苷明显降低了髓核细胞凋亡率。正常对照组椎间盘原代髓核细胞呈现CD24阳性染色，D-半乳糖诱导后阳性染色减少，补肾方有效组分淫羊藿苷和齐墩果酸可以增加阳性表达。细胞周期蛋白依赖的激酶在D-半乳糖诱导后表达受到抑制，中药有效组分组可以上调D-半乳糖诱导的细胞周期蛋白依赖的激酶。 结论: 1.D-半乳糖可以诱导SD大鼠椎间盘出现细胞衰老，补肾方具有对抗D-半乳糖诱导椎间盘细胞衰老标志物表达的作用，这种调控衰老的作用与细胞周期相关基因、蛋白表达相关。 2.3代以内的髓核细胞呈多角形，面积大，CD24染色呈阳性，与软骨细胞区别明显。在干预D-半乳糖诱导衰老的表达上，补肾方有效组分淫羊藿苷和齐墩果酸对p16INK4a/Rb通路的作用与体内实验结果一致。 3.体外3D培养椎间盘方法较好的保持了椎间盘的生物学特性，可操作性强。补肾方有效组分淫羊藿苷可以有效降低椎间盘细胞凋亡率，保持细胞分化能力，通过p16INK4a信号途径上调控椎间盘细胞衰老。