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屎肠球菌（Enterococcus faecium,E.faecium）是人和动物重要的条件性致病菌,主要引起尿路感染、腹腔、盆腔感染、败血症等,并造成人畜共患,对该病准确诊断的重要性日益增强。国内尚未有商品化的屎肠球菌检测试剂盒问世,因此建立一种快速简便,特异性好,灵敏度高的屎肠球菌临床诊断试剂盒已成为市场和基层的需要。本试验经镜检、PCR扩增测序、小鼠致病力试验、毒力基因和耐药基因扩增试验等研究,从甘肃肃南某羊场濒死羊中分离到一株屎肠球菌,暂命名为Enterococcus faecium B1Y。该菌株具有较强致病性且多重耐药,其16S rRNA基因序列与GenBank中Enterococcus faecium strain ISMMSVRE11、Enterococcus faecium isolate 2014-VREF-268等菌株16S rRNA基因序列一致性为100%。我们以Enterococcus faecium B1Y菌株为基础,研究建立屎肠球菌ELISA血清学诊断方法。荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）作为重要的毒力因子,是重要的半抗原,和相应蛋白偶联可以增强免疫原性。为提取纯化屎肠球菌CPS并测定其多糖含量,本研究采用高压法、酶解法等得到CPS粗提物,经过30 ku和100 ku超滤离心管超滤浓缩以及DEAE SEPHAROSE FAST FLOW层析柱层析后,得到纯化的屎肠球菌荚膜多糖。苯酚-硫酸法测定纯化的屎肠球菌荚膜多糖含量为75.21%。为增强荚膜多糖的免疫原性和特异性,本研究将荚膜多糖与BSA成功偶联,得到免疫原性较高的偶联蛋白,并以此作为抗原进行了屎肠球菌ELISA检测方法建立的初步探索,结果显示P/N值大于1,可明显将阴阳性血清区分。但其阴性值较大,仍需优化最佳条件。屎肠球菌胶原蛋白黏附素（adhesin of collagen from E.faecium,Acm）是屎肠球菌重要的毒力因子,具有粘附肠道,防止被清除进而致病的作用。本研究首先扩增Enterococcus faecium B1Y Acm基因,并将其连到pUC57-Kan载体上,基因测序表明该基因全长1514 bp,编码约501个氨基酸残基,与Genbank中已发表的屎肠球菌Acm一致性为99%。通过BamH I和Xho I酶切,将屎肠球菌Acm基因连到质粒pET-32a载体上,成功构建原核表达质粒pET-32a-Acm,并诱导其表达。经酶切鉴定、SDS-PAGE电泳、Western blot分析等证明表达载体构建成功,且成功表达出可溶性蛋白,分子量约为74 ku,能与绵羊屎肠球菌阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。经His镍亲和层析柱纯化得到1.2 mg/mL的目的蛋白。我们以纯化的Acm蛋白为抗原,建立了屎肠球菌间接ELISA检测方法,得到最佳条件为:Acm抗原的包被浓度为12μg/mL,37℃包被2 h后4℃过夜,封闭液选择10%的马血清,封闭条件为37℃1.5 h,待检血清的稀释倍数为1:100,37℃放置1 h,HRP兔抗绵羊二抗稀释倍数为1:500,37℃作用15 min,底物37℃显色5 min。对24份阴性血清进行测定,临界值为0.427;临床检测73份样品,ELISA检测相比PCR测序检测（NAAAS）阳性符合率63.64%（7/11）,阴性符合率为87.10%（54/62）,总符合率为83.56%（61/73）。该ELISA方法具有重复性好、敏感性较高,特异性强等优点。