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泛素/26S蛋白酶体系统对于生物体维持自身正常生长发育和适应环境起着非常重要的作用。将泛素作为蛋白标签共价连接到靶蛋白分子上需要泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的依次作用,在某些过程中还需要有类泛素结合酶(UEV)的作用。目前认为泛素化修饰的底物特异性主要由E3决定。E2的功能相对广泛,但也有一定特异性。推测实现E2功能特异性的途径之一可能是通过与不同的E3协同作用,而UEV则与E2协同参与对底物泛素化修饰的调节。但目前对E2的特异性及不同E2生物学功能的研究还比较少。本论文主要通过生化实验分析了E2/E3特异性作用及UEV对E2活性的影响,同时结合遗传学方法深入研究了一个与酵母UBC8同源的拟南芥E2亚家族的生物学功能。
为了研究植物中E2/E3的特异性,我们首先建立了一个完全由植物来源的E1、E2、E3及Ub蛋白组成的体外泛素化反应系统。其中在拟南芥分属于12个亚家族的37个E2中,通过原核系统表达纯化了10个亚家族中的至少一个E2蛋白,实验表明大部分E2具有体外泛素化活性。此外,还成功地利用烟草瞬时表达系统得到了大肠杆菌中无法表达的完整E2蛋白,通过免疫共沉淀法纯化蛋白进行泛素化反应。这为在原核系统中检测不到活性的E2蛋白提供了一个全新的研究方法。另外,选择了8个已知在不同生理途径中起作用的拟南芥E3蛋白用于研究E2/E3的特异性。分别将不同的E2和E3两两组合检测多聚泛素链的产生,发现存在明显的E2/E3特异性作用。这暗示在植物体内存在着大量的E2/E3特异性互作,也是植物生命活动重要的调节机制之一。本研究所建立的这个较为稳定、全面的植物体外泛素化反应系统还为该研究领域提供了一个系统分析平台,可以用来检测未知的或可能的E2、E3蛋白的体外泛素化活性,同时还能对已知的E3蛋白进行E2-E3特异性分析,以期能为其体内功能的研究提供更多的线索。
拟南芥基因组还有一类序列和结构与E2类似,但缺乏与泛素共价结合的Cys的基因,称为类泛素结合酶(UEV)。拟南芥编码3个亚家族共8个UEV基因。为了研究拟南芥中UEV与E2功能的相关性,本研究表达纯化了分属这3组中的5个UEV蛋白。体外泛素化实验表明它们不能与泛素蛋白形成共价结合的硫酯键。将这5个UEV分别与不同的E2组合进行泛素化活性检测,所获得的结果显示UEV1A可以增强UBC3、UBC10、UBC6、UBC35、UBC22的活性,减弱UBC13的活性；UEV1D可以增强UBC13、UBC35、UBC16的活性,减弱UBC6的活性；ELC可明显增强UBC22的活性；ELC-like明显增强UBC16的活性。
在以上全基因组水平研究的基础上,本论文还对拟南芥12个E2亚家族之一,与酵母UBC8同源的一组E2进行了具体的功能分析。拟南芥含有3个与酵母UBC8同源的E2基因:UBC4/UBC8A,UBC5/UBC8B和UBC6/UBC8C。洋葱及烟草表皮亚细胞定位表明这三个基因编码的蛋白都遍布在细胞内的各个部位。体外泛素化实验表明它们都是有功能的E2。这三个基因的T-DNA插入突变体ubc8a,ubc8b,ubc8c的种子在1/2MS无糖培养基上均能正常萌发,但都有一部分幼苗萌发后不能继续生长,而且这个比例随种子储存时间的延长而增加。已知萌发后的早期生长与种子中可溶性糖含量有关。糖含量测定显示相对于野生型,突变体幼苗中可溶性糖含量减少,淀粉增多。检测发现三个单突变体中叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)蛋白含量均有所增加,胞质和线粒体FBPase蛋白含量则没有明显变化,而叶绿体FBPase是卡尔文循环中的关键酶之一,还参与淀粉的生物学合成。这些证据表明,ArUBC8A/B/C可能参与叶绿体FBPase的降解而在光合作用中碳同化的合成与分配过程中起作用。