双酶法合成谷胱甘肽

• 作 者: 王婵
• 出 处: 北京化工大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 谷胱甘肽 谷胱甘肽双功能合成酶 ATP再生 多聚磷酸激酶 多酶催化体系 仿生固定化

谷胱甘肽是一种关键的非蛋白质硫醇化合物,广泛应用于食品和制药行业。本研究采用产物抑制作用弱的GshF酶催化酶法合成GSH的两步反应;引入PPK,催化价格低廉的多聚磷酸盐和ADP合成ATP,降低生产成本。将GshF和PPK构建到仿生载体上,实现了酶的重复利用,延长了酶的使用寿命。(1)构建了来自多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的GshF酶和来自球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PPK酶的重组表达载体。并实现了GshF和PPK酶的正确表达,表达量为4-5 mg/mL。(2)对双酶法生产GSH体系的反应条件进行了优化,得到了一系列的最优反应条件:GshF(Sa)、PPK(Rs)、T(37℃)、pH值(9.0)、ATP初始添加量(5%)、PolyP浓度(P6:Cys=1.5:1)、GshF和PPK酶量比(1:1)、氨基酸摩尔比例(3:1:3)。并且将GSH生产体系的底物浓度从30 mM扩大到50 mM。最优条件下生产GSH,GSH产量由8.76 g/L提高到13 g/L,对应转化率为86.36%;并且ATP的外源添加量仅为体系理论需求量的5%、节约了95%。(3)开创性地将来自无乳链球菌的GshF和来自球形红细菌的PPK与聚多巴胺(PDA)微胶囊支架组成仿生固定双酶催化体系。验证了固定后PPK酶的效果,优化了双酶的固定位置,并且该系统显示出更高的酶重复利用率。37℃、350rpm充氮气保护条件下,仿生固定双酶可重复使用十批并且转化率依然可以达到75.11%。该体系对辅因子再生、级联反应(循环反应)、保护多亚基酶活性提供了参考方案。