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目的:本研究通过人工合成HPV16E7多肽,制备抗HPV16E7多肽卵黄抗体(IgY),并经胃蛋白酶消化后获得IgY-Fab’片段,进一步研究IgY-Fab’片段的生物活性和稳定性。 研究方法与结果:根据前期所针对HPV16E7蛋白的MHC-Ι抗原结合表位,利用蛋白质软件分析方法,以前期筛选出的3段一致性较高及免疫原性较强的HPV16E7多肽序列做为研究对象,氨基酸序列分别为CCKCDSTLR、GIVCPICSQ、LLMGTLGIV。采用固相合成多肽方法,在自动多肽合成仪上分别合成多肽,最后经HPLC纯化,多肽合成纯度均>98％,分子质量经MS分析分别为1028.24、919.4、916.2。并与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原免疫产蛋鸡,制备抗多肽HPV16E7IgY多克隆抗体,采用聚乙二醇三步沉淀法,与卵黄液比例为1:6,pH值为7.2时所提取分离特异性抗体的纯度比聚乙二醇二步沉淀法纯度高,经SDS-PAGE电泳分析结果,IgY重链分子量约为64KDa的和轻链分子量约26KDa,Bandscan软件分析纯度达到85.4%,离子交换层析进一步纯化抗体,纯度大于91%。间接非竞争酶联免疫吸附法检测抗体效价,抗体效价分别为1:62500;1:312500;1:312500。 选取最高效价的抗HPV16E7b-IgY抗体进一步用胃蛋白酶消化IgY,在质量比1:20消化时间为9h后,可获得单一的IgY-Fab’片段,进一步纯化IgY-Fab’片段,纯化的Fab’片段蛋白浓度为0.762mg/mL,纯度为92%,SDS-PAGE电泳结果显示Fab’的相对分子质量为44KDa,效价达到1:32000,在相同的包被抗原浓度与抗体稀释度的条件下,与HPV16E7IgY抗体相比,IgY-Fab’片段的活性仍能保持在65%以上;在耐酸、耐碱等稳定性研究中,IgY-Fab’片段在65℃、pH>3、在碱性环境下活性仍能保持稳定,无明显变化。 结论:最终合成抗HPV16E7相关多肽,与BSA偶联后作为免疫原,制备了高效价的抗HPV16E7相关多肽多克隆IgY抗体,进一步获得纯度较高的IgY-Fab’片段,仍能保留较高的生物活性,稳定性较高。