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目的本课题的研究目的是筛选37种物种线粒体(mtDNA)序列中的种属特异性位点,应用焦磷酸测序技术建立简便易行的大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17种常见动物的法医学种属鉴别体系并进行法医学应用研究。方法根据NCBI数据库查到的上述37个物种线粒体序列,利用Dna SP v5.10.1软件筛选DNA中核酸差异大的目标区域,分别命名为12S-1,12S-2,16S-1。针对3个目标区域,使用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物分别进行目标区域扩增。通过优化选择目标区域12S-2,使用PyroMarker Assay Design 2.0软件设计测序引物,利用PyroMarker Q96仪器进行大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17种PCR产物(片段大小约100 bp)测序,建立基于焦磷酸测序技术的种属鉴定反应体系,并抽取部分种属样本进行Sanger测序验证及灵敏度等法医学验证研究。结果(1)建立了基于焦磷酸测序技术检测12S rRNA基因进行种属鉴定体系。焦磷酸测序分析结果显示该方法仅需要12个碱基数就可以快速准确地区分。(2)本方法能够准确分型的最低DNA模板量为250pg;对煮熟肉类、陈旧血痕和未知种属来源的样本均能有效鉴别。结论本研究建立的基于焦磷酸测序技术分析12S rRNA基因的鉴别体系,可以成功鉴别大鼠,鹅,猪,黄牛,山羊,鸡,鸭,狗,小鼠,猫,鸽,人,马,兔,驴,甲鱼和鹿这17个物种。本方法具备良好的准确性和稳定性,灵敏度达到250pg,对特殊样本和未知来源的检材都可成功鉴别。本方法操作简单、快捷、成本低,能够满足法医学种属鉴定的要求。