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枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶超家族(subtilase superfamily)是丝氨酸蛋白酶(serineprotease)最主要的成员之一。在真菌中,该类超家族的蛋白酶广泛存在并发挥着重要的生理作用。近年来,随着大量枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶序列的公布,同时完成基因组测序的真菌也日益增多,使得从分子进化的角度对真菌枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因进行更加深入和全面的分析成为可能。本论文从分子进化的角度对真菌,尤其是食线虫真菌(nematophagous fungi)基因组中的枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因进行了全面的分析。主要结果为:
通过对盘菌亚门(Pezizomycotina)真菌枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因进行分子进化分析,结果表明盘菌亚门真菌的枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶很可能经历了一个从胞内向胞外的进化过程,该进化过程使得蛋白酶摆脱了空间的束缚,更有利于功能的发挥。鉴于本研究中所包含的来源于昆虫病原真菌和内寄生线虫真菌的体壁降解丝氨酸蛋白酶混乱的聚类在相同的分支上,推测这些来源于昆虫病原真菌和内寄生线虫真菌的体壁降解丝氨酸蛋白酶在侵染昆虫和线虫的过程中具有相类似的功能,并进一步推测某些昆虫病原真菌和内寄生线虫真菌对线虫和昆虫均具有侵染作用。这一推论在随后使用麦角菌科真菌同时对线虫卵和昆虫卵进行侵染的生测实验中得到证实。本研究结果丰富了对昆虫病原真菌和内寄生线虫真菌侵染机制的理论认识,也为双功能生防制剂的研究和开发奠定了理论基础。
通过对存在于48个真菌物种基因组中的四个枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因家族的成员分别进行分子进化分析,结果显示48个真菌物种所包含的枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶各个基因家族的数目差异极大,基因数目的差异可能反映了不同世系或物种对其所处环境的适应。真菌中,枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶四个基因家族的序列具有不同的进化模式,其中蛋白酶K基因家族的进化模式最为复杂。蛋白酶K基因家族和Ⅰ类枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因家族的蛋白酶基因在进化过程中发生了大量的基因重复和丢失事件;重复产生的基因形成了功能分化,在真菌中发挥着重要的作用。这些蛋白酶的功能多样性可能与真菌物种多样性具有一定相关性。
对目前所有已知的捕食线虫真菌的15条体壁降解丝氨酸蛋白酶进行适应性进化分析,结果表明捕食线虫真菌体壁降解丝氨酸蛋白酶至少在进化的早期受到了正选择压力的作用,因此推测枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶基因曾在正选择的作用下快速进化出降解体壁的功能来帮助捕食线虫真菌完成对线虫的侵染。对存在于寡孢节丛孢基因组中的20条蛋白酶K基因家族的基因进行适应性进化分析,结果表明某些蛋白酶K基因在进化过程中受到了正选择作用,推测这些受到正选择作用的蛋白酶基因在寡孢节丛孢中具有重要的功能。
此外,本论文还对来源于中国7个地理区域共80株淡紫拟青霉真菌菌株进行遗传多样性分析。对淡紫拟青霉真菌6个基因片段的分析发现,6个基因片段具有不同的多态性水平。来源于我国南方的淡紫拟青霉菌株具有很高的遗传多样性,这说明我国南方具有丰富的淡紫拟青霉遗传资源,这些资源对于研究淡紫拟青霉的多样性和侵染机制具有十分重要的意义。对淡紫拟青霉遗传多样性的研究,能为将来更好的利用和保护这一重要的生防真菌资源奠定理论基础。
本论文的创新点主要表现为:
1)对盘菌亚门真菌枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶进行全面的分子进化分析,首次提出两个假说:一是盘菌亚门真菌枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶是从胞内进化到胞外的假说;二是来自于昆虫病原真菌和内寄生线虫真菌的体壁降解丝氨酸蛋白酶在侵染昆虫和线虫的过程中,具有相类似的功能的假说。
2)首次从分子进化水平对存在于48个真菌物种基因组中的枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶四个基因家族的成员进行全面的分析,进一步认识到该类蛋白酶在经历了漫长的进化历程后,具有明显的功能多样性,在真菌生活史中发挥着重要的作用。
3)揭示了捕食线虫真菌所分泌的体壁降解丝氨酸蛋白酶在进化过程中确实经历了正选择作用,说明这类蛋白酶在很短的时间内将对真菌有利的氨基酸突变迅速积累并固定下来,通过正选择作用产生功能分化,形成了降解体壁的功能以帮助捕食线虫真菌完成对线虫的侵染。
4)发现寡孢节丛孢蛋白酶K基因家族的一些基因在进化过程中受到正选择作用,为进一步揭示寡孢节丛孢枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶的功能奠定了很好的理论基础。