【摘 要】
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根据布鲁氏菌病致病力因子-四型分泌系统中的VirB8基因序列,设计引物,建立了检测布鲁氏菌病的PCR方法,用于布病的早期诊断和致病力因子的检测。对布鲁氏菌标准株、疫苗株及新
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根据布鲁氏菌病致病力因子-四型分泌系统中的VirB8基因序列,设计引物,建立了检测布鲁氏菌病的PCR方法,用于布病的早期诊断和致病力因子的检测。对布鲁氏菌标准株、疫苗株及新疆分离株的分析检测结果表明,VirB8-PCR检测方法与分菌实验符合率为100%,特异性在90%以上,敏感性为153fgDNA(相当于30个菌)。该方法重复性和稳定性好,预混液-20℃保存期6个月以上。此外,本实验对7株布鲁氏菌VirB8基因进行了克隆测序,同源性在99.3%以上,该结果表明VirB8基因片段是一段高度保守序列,对于布鲁氏菌病的检测结果比较准确、可靠。本实验还采用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、iELISA、cELISA和PCR方法对4个养殖场的1354只家畜(713头牛,641只羊)进行了布病检测,其中牛阳性率为30.2%,羊阳性率为19.7%,检测结果表明布病的发病率呈明显上升趋势。用选择性培养基对采集样品进行细菌分离培养,同时利用VirB8-PCR对布病可疑菌落(49个)进行检测并鉴定,判定13个菌落为布鲁氏菌。经AMOS-PCR鉴别,其中12株为牛型;1株为羊型,经生化鉴定为羊Ⅲ型。国际标准S19株的赤藓醇代谢基因(Erythritol catabolic gene,简写Ery)缺失702 bp,而我国的A19株具有完整的Ery基因。参照GenBank中布鲁氏菌牛种2308的Ery基因序列,设计一对特异性引物,以国际标准参考株S19,中国天康疫苗株A19-1,中国中监所标准株A19-2的DNA为模板,扩增不同来源的3株19号疫苗株的Ery基因,并对PCR产物进行克隆、测序分析。与2308的Ery基因比较,S19的Ery基因缺失702碱基,两株中国来源的A19株不缺失,但该基因阅读框的3个碱基发生了改变,即51,52位CG变为GC ,521,522,523位缺失AGG,547位T变为C。由此而引起3个氨基酸发生了变化,即13位精氨酸(Arg)变为丙氨酸(Ala),170位苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala),178位缬氨酸(Val)变为丙氨酸(Ala)。
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