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鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方及东南亚常见的恶性肿之一。类似其它许多肿瘤，鼻咽癌是一种多基因多阶段侵袭性疾病，与多种瘤基因、抑瘤基因的调控失常相关，但目前其确切的分子机制仍未清晰阐明。高频率杂合性丢失位点往往与抑瘤基因关系密切，有研究显示NPC在3p14-25、9p、11q等处存在此类位点，尤其是3p21-26区域杂合性丢失频率高达66.70％，提示该区域定位有与NPC发生发展密切相关的某种或某些未知的肿瘤相关基因。 由于一个表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)直接代表一个表达基因，因此，我们充分利用现有数据库中的大量EST资源，运用现代生物信息学技术，从NPC高频率LOH位点3p21区域的ESTs着手，有目的地筛选位于鼻咽癌高频率杂合性丢失区域的EST，应用逆转录PCR(RT—PCR)和Northern blot方法，检测鼻咽 中南大学 博士学位论文 癌活检组织和细胞株中相应基因片段的表达水平，筛选、鉴定与鼻 咽癌成负相关的CDNA片段，为克隆鼻咽癌相关新抑瘤基因寻找突破 日。 通过RT干CR检测，我们发现2个ESTS在鼻咽癌活检组织和细 胞系中表达明显下调或检测不到其表达产物，这2个BSTs位于染色 体 3PZI 区域，分别是EST N31985和 EST BG772301。EST N31985在 60．00y（3／5例）的鼻因癌细胞系（HONEI，HNEI，CNEZ）禾 47．06％ 门6亿4例）的鼻咽癌组织中表达下调，并在 3例鼻咽癌组织原代细 胞培养时，观察到其中2例表达下调的标本癌细胞生长迅速，而1例 表达正常的标本癌细胞则生长缓慢。推测N3 1985代表的基因可能具有 抑制肿瘤细胞生长的作用。EST BG772301在 20．00＊门乃例）鼻咽癌 细胞系u）和 41．18％Q4亿4例）鼻11因癌组织中表达下调，另在 1例白血病细胞系＊L卡0）也未见表达。 MTE’mArrayZ 72组织膜Northern blot杂交结果显示：N31985 和 BG772301两个 ESTS在正常人多种组织中均有表达，而在 8不月 瘤细胞系杂交信号均较弱；EST N31955以 Burki讨氏淋巴瘤细胞系 山audi）杂交信号最弱，表明 EST N31955所代表的基因表达下调不仅 见于上皮性肿瘤（鼻咽癌厂 也存在于间胚叶来源的肿瘤（淋巴瘤入 而 EST BG772301在白血病细胞系讥－60则无杂交信号。推狈这2个 ESTS 所代表的基因表达下调，可能参与了多种肿瘤的发生发展，可能是2 个新的候选抑瘤基因。提示这2个ESTS可能为候选抑瘤基因的CDNA 片段。 2 中南大学 博士学位论文 我们 对这 2个 ESTS分别进行 基回全长 CDNA克隆。EST N31985， 采用质粒 CDNA测序和 RACE方法，获得该基因全长为 1271hp 的 CDNA 新序列，该序列含完整阅读框，编码 146个氨基酸，由国际基因命 名委员会（HUGO）命名为STGC3基因（GenBank登录号：AY078383）， 与人类基因组草图大规模测序数据库中新近公布的序列NT03453进 行比较分析，将 STGC3基因定位于 3P2，由 1个外显子组成。EST BG77230，我们 采用质粒 CDNA测序，获得该基因全长为 2377 hp的 dNA新序列，该序列含完整阅读框，编码m9个氨基酸，由国际基 因命名委员会（HUGO）命名为 NPCEDRG基因（GenBank 登录号： AF538 50X与人类基因组草图大规模测序数据库中新近公布的序列 NT022439卜较分析，1 NPCEDRG基因定位于 3P2，由 6个夕显子和 5个内含子组成。 我们 通过构建PEGFP－CZ／STGC3和 PEGFP－CZ／NPCEDRG荧光融合蛋 白表达载体，检测 STGC3和 NPCEDRG基因编码蛋白在细胞内的表达及 定位，观察到STGC3蛋白质存在于细胞浆及细胞核；NPCEDRG蛋白主 要聚集在细胞核内（核、核仁及核膜厂 因而推测后者可能与细胞分 裂增殖及基因的转录调控相关。 我们 构建了 PGEX－4T－2／STGC3和 PGEX－4T－2／NPCEDRG原核表达载 体，转染 JM 09大肠杆菌，诱导新基因编码蛋白质在原核生物大肠杆 菌中的表达，SDS－PAGE胶电泳检坝到分子量分别为42KD和45KD的融 合蛋白，为下一步抗体制备、基因蛋白质表达水平等方面的进一步研 究打下基础。 3 中南人学 博士学位论义 为了分别观察 STGC3和 NPCEDRG基因表达上调后，对鼻咽癌细 胞蛋白质表达的改变及恶性表型的影响，我们构建 pCDNA（）3．1／STGC3和 pCDNA（）3．1／NPCEDRG真核表达载体，应用脂 质体转染技术，将 STGC3和 NPCEDRG基因分别导入其低表达的低分化 鼻咽鳞癌细胞系CNEZ中，并用G418筛选，RT干CR鉴定，建立了稳 定表达STGC