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第一部分小鼠Brg1慢病毒干扰载体构建及验证
目的:构建小鼠Brg1(Brahma-related gene1)特异性shRNA慢病毒载体并检测其对小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中Brg1的沉默效应。方法:针对小鼠Brg1 mRNA序列，设计合成3对短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列，退火形成双链后连入PLL3.7载体;经酶切和测序鉴定后，将重组慢病毒质粒和包装质粒共转染293T细胞，包装得到病毒颗粒并检测其滴度。将病毒液以感染复数(MOI)为5、15和30分别感染BM-MSCs，72h后计算转染效率。将3种病毒液以最佳MOI感染BM-MSCs，同时设未感染病毒的正常对照(Control)组和感染空载体病毒的阴性对照(GFP)组，72h后Real time PCR检测Brg1 mRNA水平变化，计算抑制效率得出最佳干扰序列。结果:双酶切及测序结果证实干扰序列插入正确，MOI为15时对BM-MSCs转染效率最高(90％)，且细胞状态好;与GFP组相比，Brg1-shRNA2干扰效率为82.35％，沉默效果最佳。结论:构建的小鼠Brg1-shRNA慢病毒载体能有效降低BM-MSCs中Brg1 mRNA水平，为进一步研究其在BM-MSCs定向分化肝细胞中的功能奠定了基础。
第二部分 Brg1促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化
目的:了解Brg1在BM-MSCs定向分化肝细胞中的作用。方法:全骨髓差异贴壁法分离培养获得P3-P6代BM-MSCs，添加HGF、FGF4培养7d后，Realtime PCR和Western blot检测Brg1、AFP和Foxa2表达水平，ChIP检测AFP、Foxa2基因启动子区Brg1招募水平，以未诱导0d组为对照。将Brg1慢病毒干扰载体转染BM-MSCs，并设空白对照(Control)组和阴性对照(Lv-GFP)组培养24h，换液后添加HGF、FGF4进行培养，7d后检测各组Brg1、AFP和Foxa2表达水平及AFP和Foxa2基因启动子区结合的Brg1水平。结果:HGF、FGF4诱导BM-MSCs分化第7d，Brg1、AFP和Foxa2表达明显升高，AFP和Foxa2启动子区招募Brg1水平也明显升高。干扰Brg1后添加HGF、FGF4进行诱导培养，AFP和Foxa2表达明显下降，AFP和Foxa2启动子区结合的Brg1也显著降低。结论: Brg1促进BM-MSCs定向分化肝细胞，上调肝分化早期分化因子AFP和Foxa2的表达。