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原发性支气管肺癌（简称:肺癌）是目前全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。肿瘤干细胞是一群具有无限增殖、多分化潜能、高侵袭转移、强耐药和耐辐射的细胞群，被认为是肿瘤发生发展、复发转移的“根源”[4-6]，为肿瘤的治疗提供了新的视角。因此，若能从中医宝库中寻找到能抑制肺癌干细胞的药物成分，将对临床治疗肺癌提供有价值的参考，并有助于推动中医中药现代化进程。 我们通过前期的实验和临床研究显示，“扶正祛邪”理论指导下组方的抗肺癌“扶正祛邪”系列复方，可以提高肺癌患者的生活质量[7，8]，抑制肺癌A549细胞增殖，逆转上皮间质转化的发生[9]。在前期研究的基础上，为了更深入探研扶正祛邪复方及其组分抗肺癌作用及其机制，我们首先通过动物实验筛选并精简出具有显著抑瘤作用的益气解毒方，其次对该复方进行拆方研究，明确该复方及其组成药物的功能和定位，初步阐明该复方抗肺癌的作用机制;最后对该复方中“祛邪”抑瘤的主要组分血根碱进行了较为系统的深入研究，以阐明其抗肺癌及肺癌“干细胞样特性”（简称“干样”）细胞作用及其机制，并取得了一些较有价值的结果，兹概述如下。本研究内容共为以下五个部分。 第一部分 通过Lewis肺癌小鼠模型筛选精简出体内有效抑瘤复方:益气解毒方 目的:将前期研究有效的“扶正祛邪”系列方主要成分，根据李雁教授临床经验拆成9个精简复方，通过动物模型筛选出最佳有效的抑瘤复方。 方法:构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型，以0.9％生理盐水为对照组，观察9个用药组与对照组皮下移植瘤体积的差异。 结果:益气解毒方（组成:人参和白屈菜）抑瘤效果最强，可以显著抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的生长，实验结束时瘤块体积为(798.12±98.32)mm3，对照组为(1476.84±234.67)mm3，p=0.0245＜0.05，差异有统计学意义。 第二部分 益气解毒方、拆方及其“祛邪”药单体成分抗肺癌作用的体内外研究 目的:研究益气解毒方全方及其拆方各组（人参组和白屈菜组）抗肺癌的初步机制，明确各组成在全方中的作用和地位;并从方中探寻到目前报道较少且能有效抗癌的单体成分。 方法:体内观察全方及其拆方各组对Lewis肺癌皮下移植瘤的影响，通过MTT及ELISA实验检测各组对小鼠脾淋巴细胞增殖及免疫器官（脾脏和胸腺）中细胞因子IL-2，TNF-α分泌的情况;体外观察各组对A549和H1299肺癌细胞增殖能力的影响，进一步用MTT法和划痕实验筛选白屈菜中的主要抑瘤成分。 结果:(1)和对照组比，益气解毒方全方及其拆方各组的瘤块均减小，差异均有统计学意义。抑瘤率分别为全方组最高47.78％，白屈菜组37.38％，人参组25.83％;(2)人参组体内可以显著提高脾淋巴细胞增殖并增加小鼠脾脏和胸腺中的IL-2与TNF-α含量表达(p＜0.01），体外无直接抑制A549及H1299细胞增殖的作用(p＞0.05);(3)白屈菜体内无明显提高机体免疫作用，但体外实验中在1mg/ml作用48h后，对A549及H1299细胞抑制率可达到(42.53±0.09)％和(44.58±0.04)％。可视为全方的主要“祛邪”成分。(4)白屈菜中的主要成分血根碱在2ug/ml作用24h后，对A549和H1299细胞的抑制率可高达(85.32±0.08)％、(92.32±0.03)％(p＜0.001)，且可以显著抑制肺癌细胞发生迁移侵袭。 第三部分 肺癌“干细胞样特性”细胞的构建及鉴定 目的:在上一部分发现益气解毒方中“祛邪”中药白屈菜的单体成分血根碱有很强的抑制肺癌细胞增殖及阻断肺癌细胞侵袭迁移的作用，而基于对肺癌干细胞具有使肺癌快速增殖、使其复发转移“根源”的认识，我们考虑血根碱是否同时抑制了肺癌细胞中的“干细胞”成分。本部分通过构建并鉴定具有干细胞特性的肺癌细胞，为后续研究血根碱与肺癌“干样”细胞之间的关系提供细胞基础。 方法:通过分子克隆法将干细胞核心调控基因Oct3/4和Nanog稳转到肺腺癌细胞(A549和H1299)中，并用干细胞无血清培养基加压维持干性，构建稳定表达干细胞特性的肺癌“干样”细胞;再通过一系列体外悬浮球、平皿克隆、Transwell、流式CD133+/CD44+、顺铂耐药、耐药基因PCR检测、Western blot检测间质分化蛋白潜能以及体内裸鼠成瘤实验，对构建的质粒组细胞进行“干样”特性鉴定。 结果:(1)成功构建真核表达质粒egfp-ffluc-hytk-Oct3/4-Nanog，并转染肺腺癌细胞株上，通过潮霉素加压、挑单克隆及干细胞悬浮培养后，经PCR和Western blot检测，获得了稳定高表达Oct3/4和Nanog的A549和H1299质粒组细胞（以及空载对照组）(p＜0.01)。(2)质粒组细胞可以在无血清悬浮培养条件下形成数目众多、形态紧密的悬浮球，具有更强的自我更新能力。(3)质粒组有更强的增殖能力(p＜0.05)和强侵袭转移能力(p＜0.05)。(4)质粒组细胞表面CD133+和CD44+明显高于空载对照组(p＜0.05)。(5)质粒组细胞具有更强的顺铂耐药性，且主要耐药基因MDR1、MRP1、ABCG2均上调(p＜0.05)。(6)质粒组细胞呈现上皮-间质分化的形态，Vimentin(波形蛋白)的表达明显高于对照组，具有更强的分化潜能。(7)质粒组可以在体内用较少的细胞快速成瘤，瘤体生长迅速(p＜0.01）。 第四部分 血根碱抑制肺癌“干细胞样特性”细胞的体内、体外研究 目的:观察血根碱对肺癌“干样”细胞(A549质粒组和H1299质粒组)生物学特性的影响，验证之前提出的合理假设。 方法:体外通过MTT、划痕、Transwell、悬浮球、AnnexinⅤ/PI流式细胞等实验观察血根碱对肺癌“干样”细胞增殖、迁移、侵袭、自我跟新及凋亡的影响;并通过体内实验，进一步观察血根碱对肺癌“干样”细胞瘤块生长情况的影响: 结果:(1)筛选到血根碱最低有效浓度为4μM;对包括肺癌“干样”细胞的多个肺癌细胞株具有广谱杀伤作用(p＜0.001)，对正常组织来源的细胞无明显抑制作用(NS，p＞0.05)。(2)血根碱可以明显抑制肺癌“干样”细胞侵袭及转移(p＜0.001)。(3)血根碱可以使肺癌“干样”细胞形成的悬浮球裂解、散落、死亡，直至完全消失;(4)血根碱可以促进肺癌“干样”细胞凋亡，尤其是早期凋亡，且呈一定的剂量依赖性(p＜0.05)。(5)血根碱可以抑制体内肺癌“干样”细胞瘤块生长，高剂量组抑瘤率为45.21％(p＜0.05)，低剂量组为40.04％(p＜0.01)，且低剂量组无明显毒副反应。 第五部分 血根碱靶向Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌“干细胞样特性”细胞的机制研究 目的:深入研究血根碱对肺癌“干样”细胞的作用靶点及信号通路。 方法:采用DNA微阵列技术及GO和KEGG数据库富集，对血根碱作用前后的肺癌“干样”细胞进行基因表达谱分析，筛选出差异表达的基因和信号通路;对分析出的核心差异基因分别用RT-PCR及Western-blot进行验证。 结果:(1)血根碱处理前后，两个细胞系中均发生差异表达的基因有1574个，其中上调679个，下调895个(p＜0.05);主要涉及细胞粘附、信号转导、侵袭转移等方面。(2)通过GO及KEGG富集分析，找到差异基因主要参与的信号通路集中在“Adherens junction”，“Focal adhesion”，“Wnt”，“PI3K-Akt”等;(3)将KEGG数据库与主要信号通路及差异基因相互映射，发现与肿瘤干细胞及肺癌发生发展关系密切的Wnt信号通路及其上的核心基因发生了明显的下调。(4)通过RT-PCR及Western blot验证，CTNNB1(即β-catenin)、snail、cyclin-D1、Akt表达均发生了显著下调(p＜0.01)，与芯片分析结果一致。 结论：(1)根据“扶正祛邪”治则组方的益气解毒方，在体内具有显著的抑瘤率; (2)益气解毒方全方及各自组成在体内均有抑瘤作用，但各自抑瘤的机制不同; (3)益气解毒方中的人参无体外抑瘤效果，且会降低全方的体外抑瘤效果，表明人参不是通过直接杀伤癌细胞而抑瘤，而是通过间接诱导和增强各种免疫细胞因子（如IL-2、TNF-a等），从而激活机体免疫系统，增强免疫细胞（T细胞、B细胞等）功能而产生抑瘤作用; (4)益气解毒方中的白屈菜体内无提高机体免疫作用，甚至反而会影响全方对机体免疫功能的改善作用;白屈菜在体内、外均具有直接抑瘤作用。其主要单体成分血根碱，具有很强的杀伤肺癌细胞及抑制肺癌细胞侵袭转移的作用。 (5)通过分子克隆Oct3/4和Nanog，将其稳转到肺腺癌细胞中，并用干细胞培养基加以悬浮培养，经过一系列体内、体外实验鉴定，表明此法可以获得稳定表达肿瘤干细胞特性的肺癌“干样”细胞。 (6)血根碱在较低的浓度下，对肺癌“干样”细胞体内、体外均有明显抑制增殖、侵袭转移及促进凋亡的作用。 (7)血根碱抑制肺癌“干样”细胞的机制可能与靶向β-catenin及其下游靶基因，通过直接下调Wnt/β-catenin信号通路，间接阻断了上皮间质转化的发生，从而抑制了肺癌“干样”细胞的自我更新和远处的转移能力。