抗重金属铅离子mAb的制备及ELISA检测方法的建立

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铅是的用处极广,同时也是对人类危害最大的重金属。近年来,铅的污染问题日益严重,遭受其危害的人数也越来越多。铅对机体毫无益处,对神经系统、心血管系统、生殖系统、消化系统、免疫系统等都有毒害作用。由于重金属传统检测方法的诸多弊端,本论文利用免疫学分析技术制备出抗铅离子单克隆抗体,研制出铅离子检测试剂盒,建立了重金属铅离子快速检测体系。通过异硫氰酯法将铅离子和蛋白分子(BSA/OVA)偶联到双功能偶联剂ITCBE上,制备出人工抗原Pb2+-ITCBE-BSA和Pb2+-ITCBE-OVA,并通过包括紫外分光光度法、ICP-AES法、SDS-PAGE、免疫鼠多抗血清ELISA鉴定,证明人工抗原制备成功。其结果为:Pb2+-ITCBE-BSA和Pb2+-ITCBE-OVA的蛋白浓度分别为5.26mg/mL、6.90mg/mL,其Pb2+含量分别为46.14mg/L、18.60mg/L;Pb2+-ITCBE-BSA免疫小鼠后效价达到1:1.024×105,阻断ELISA检测到多抗血清对Pb2+的半数抑制浓度IC50为25.88ng/mL,与其他重金属离子基本上无交叉反应。用Pb2+-ITCBE-BSA免疫5只Balb/C小鼠,通过ELISA检测多抗血清的方法挑选出最优小鼠,取其脾脏与NS0细胞进行融合。通过ELISA法对杂交瘤细胞上清液进行检测后,筛选出1B7F4,2G5A2,2B7C11三株对Pb2+敏感特异的单克隆杂交瘤细胞株。运用体外诱生腹水法大量制备抗重金属Pb2+单克隆抗体。其结果为:1B7F4,2G5A2,2B7C11三株单抗细胞株上清液ELISA检测效价分别为1:2.56×103、1:1.28×103、1:2.56×103,IC50分别为37.068ng/mL、45.081ng/mL、34.276ng/mL,其同种型鉴定结果分别为IgG1/κ、IgG1/λ、IgG2a/κ,与其他重金属基本上无交叉反应。其中特异性最好的2B7C11单抗细胞株亲和常数Ka为2.69×109,腹水效价为1:1.6384×105.对试剂盒最佳工作浓度的选择进行测定,用2B7C11株产生的单抗组装Pb2+检测试剂盒,并对其性能进行测定。该试剂盒的灵敏度为5.32ng/mL.饲料样、猪尿样、猪血清样的平均添加回收率分别为82.14、82.76%、82.64%,平均批内变异系数分别为14.5%、14.2%、13.2%,平均批间变异系数分别为13.23%、11.73%、14.3%,与其他重金属基本上无交叉反应,且试剂盒性能稳定。
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