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肠道健康关系着动物整体健康和生产效率的高低。然而，肠炎在规模化猪场中普遍存在，给养殖业带来严重损失。前人研究结果表明，壳寡糖(chitosan-oligosaccharide，COS)具有一定的抗炎作用，但是有关其在猪肠道中的抗炎效应及可能机制的研究还很缺乏。本研究旨在利用重组猪TNF-α蛋白诱导猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞构建炎症模型，研究COS对猪肠上皮细胞炎症的抑制效应及其机制。 试验1 肠上皮细胞炎症模型的建立 通过测定不同浓度TNF-α对IPEC-J2细胞活力、炎性因子分泌量及其mRNA表达的影响，确定TNF-α诱导肠上皮细胞炎症的适宜浓度和时刚，构建炎症模型。结果显示，不同浓度TNF-α(0ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL)对细胞活力影响不显著(P＞0.05);各浓度TNF-α诱导细胞6h，均能够显著增加TNF-α、MCP-1、ICAM-1和IL-8 mRNA的表达(P＜0.05)，但是对IL-6的基因表达影响不显著(P＞0.05)。因此，本研究选取较小的TNF-α浓度，即50ng/mL作为诱导浓度。在此基础上，进一步研究诱导不同时间(3h、6h、12h和24h)对炎性因子的分泌及其mRNA表达的影响。结果显示，当50ng/mLTNF-α分别处理3h、12h时，能显著增加细胞上清液中IL-8浓度(P＜0.05）;TNF-α能够显著增加不同时间点(3h、6h、12h和24h)IL-8、IL-6、TNF-α、MCP-1和ICAM-1的mRNA表达水平（P＜0.05），以及3h、6h和12h IL-1β mRNA表达水平(P＜0.05)。因此，综合考虑炎性因子浓度和mRNA表达量，确定TNF-α处理的最佳浓度和时间分别为50ng/mL和3h。 试验2 COS对TNF-α刺激猪肠上皮细胞炎症反应的影响 本试验通过MTT法筛选出不影响细胞活力的各COS浓度，然后将不同浓度的COS与TNF-α共同培养3h，检测相关炎性细胞因子以及紧密连接蛋白mRNA的表达。结果显示，当COS浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL和200μg/mL时对细胞活力无显著影响(P＞0.05)，但是当COS浓度达300μg/mL及以上时，显著抑制细胞活力(P＜0.05)。当COS浓度为200μg/mL的时候，影响了细胞在培养板底部的均匀分布，造成细胞正常生长受阻。因此，试验选取浓度在100μg/mL以内进行COS抗炎症试验。研究包括6个处理，分别为对照组（不添加COS和TNF-α），TNF-α诱导组，以及分别在TNF-α诱导组中同时添加1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL COS。结果显示:添加COS后能够显著抑制TNF-α诱导的TNF-α、IL-8、MCP-1和ICAM-1的mRNA表达(P＜0.05)，并呈现出一定的剂量浓度效应，在COS浓度为100μg/mL时抑制作用最强;添加COS还能显著抑制TNF-α诱导的NF-κB的表达（P＜0.05）;而各浓度的COS对抗炎细胞因子TGF-β无显著作用（P＞0.05）。随着COS浓度的增加，COS有降低ZO-1 mRNA表达的趋势(P=0.06)，但是对Occludin无显著影响(P＞0.05); TNF-α能够显著增加Claudin-1的mRNA表达（P＜0.05），而相比TNF-α诱导组，同时添加50μg/mL和100μg/mL浓度的COS显著抑制了Claudin-1的mRNA表达（P＜0.05）。 试验3 COS作用受体的研究 本试验通过甘露糖受体的配体甘露糖(MAN)作为竞争性抑制剂，研究COS是否会通过肠上皮细胞的甘露糖受体发挥抗炎作用。试验共设5个处理组，分别为对照组（不添加COS、TNF-α和MAN组），TNF-α诱导组，COS（100μg/mL）+TNF-α组，MAN(100μg/mL)+TNF-α组，COS(100μg/mL)+MAN(100μg/mL)+TNF-α组。结果显示，COS能够显著抑制TNF-α诱导的IL-8、MCP-1和TNF-α的表达(P＜0.05)，在共同添加COS和MAN后，COS依然能够显著抑制IL-8和MCP-1的mRNA表达(P＜0.05)。结果表明，在IPEC-J2细胞中，COS发挥抗炎作用不通过或者不是主要通过甘露糖受体发挥作用。 试验4 COS作用通路的研究 本试验选取PKA特异性抑制剂H89，探究COS是否会通过cAMP/PKA信号通路发挥抗炎作用。试验共设4个处理，分别为对照组（不添加COS、TNF-α和H89），TNF-α诱导组，COS（100μg/mL）+TNF-α组，COS(100μg/mL)+H89（100nmol/L）+TNF-α组。结果显示，COS能够显著抑制TNF-α诱导的IL-8、TNF-α和MCP-1的mRNA表达(P＜0.05);添加H89后，COS对IL-8 mRNA表达的抑制作用显著降低(P＜0.05);但是对MCP-1、ICAM-1、TNF-α和NF-κB的mRNA的表达无显著缓解(P＞0.05)。结果表明COS的抗炎作用，特别是降低IL-8的产生与cAMP/PKA信号通路有关。 试验5 COS与IPEC-J2细胞结合特点初步研究 本试验将FITC与COS结合，通过荧光显微镜观察COS与细胞结合情况。结果显示，随着FITC-COS处理时间的增加，细胞内的荧光逐渐增加，当FITC-COS与细胞处理12h后，COS能够广泛的分布于细胞中。表明，COS有可能通过进入细胞内发挥其抗炎效应。 综上所述，本研究在成功构建IPEC-J2细胞炎症模型基础上，研究发现COS能够通过抑制TNF-α、IL-8、MCP-1和ICAM-1等炎性细胞因子的表达缓解IPEC-J2细胞炎症;甘露糖受体不是COS在IPEC-J2细胞上发挥抗炎作用的主要受体;COS发挥抗炎作用与cAMP/PKA信号通路有关。