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目的:在体筛选出一条对γ-氨基丁酸转运体-1(γ-aminobutyric acidtransporter-1,GAT-1)基因干扰效率最高的小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)。进而将筛选出的干扰效率最高的siRNA鞘内注射入神经病理性痛大鼠,观察鞘内注射GAT-1 siRNA对神经病理性痛大鼠的影响。
方法:1.根据查得的大鼠GAT-1蛋白在GenBank中的基因序列,由百奥生物利技(南通)有限公司设计合成3条GAT-1 siRNA(GAT-1 siRNA-1,GAT-1 siRNA-2,GAT-1 siRNA-3)。雄性SD大鼠坐骨神经结扎1天后,鞘内注射GAT-1 siRNA与载体LipofectamineTM2000(lipo2000)混合液,注射剂量为2μg·d-1。连续鞘内注射3天后,取大鼠脊髓背角Western blot检测GAT-1蛋白表达的变化;
2.实验分3组:GAT-1 siRNA组、MS siRNA组和载体组。将筛选的干扰效率最高的GAT-1 siRNA-3+lip02000(GAT-1 siRNA组)和MS siRNA+lip02000(MS siRNA组)鞘内注射入坐骨神经结扎后大鼠,2μg/天、连续3天;载体组只鞘内注射lipo2000。分别于鞘内注射后第1、3、5、7、10天检测大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawallatency,TWL)的变化,并于各时间点取大鼠脊髓检测大鼠脊髓背角GAT-1蛋白表达量的变化。
结果:1.所设计合成的3条GAT-1 siRNA中,与对照组DEPC水组比,GAT-1siRNA-1的RNA干扰效率约为35％;GAT-1 siRNA-3能产生约50％的RNA干扰效果,而GAT-1 siRNA-2组和阴性对照siRNA组与DEPC水组间并没有差别。
2.鞘内注射GAT-1 siRNA-3后,与载体组比,大鼠脊髓背角神经元GAT-1蛋白表达约减少50％(P＜0.01);MS siRNA组与载体组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.鞘内注射GAT-1 siRNA-3后,与载体组比,大鼠机械缩足反射阈值增加、热缩足反射潜伏期延长;MS siRNA组与载体组比较,大鼠机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期差异无统计学意义。
结论:1.鞘内注射GAT-1 siRNA能有效减少大鼠脊髓背角GAT-1蛋白的表达;
2.鞘内注射GAT-1 siRNA能通过减少大鼠脊髓背角GAT-1蛋白的表达而缓解大鼠神经病理性痛。