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背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病。目前研究发现,肠道菌群与AD的发生密切相关。然而,大多研究仅局限于对AD患者肠道菌群结构的观察,对肠道菌群与AD认知功能改变及相关分子病理学机制的研究并不明确。因此,本课题利用SPF级APPswe/PS 1△E9双转基因AD模型(PAP)小鼠、SPF级野生型(WT)小鼠、无菌PAP小鼠和无菌WT小鼠探讨肠道生态失衡与AD发生发展的相关性。进一步并筛选与AD相关的益生菌,并探讨其对AD的影响,以期为研究AD发病机制及潜在临床治疗方法提供新思路。方法1)实验分组:分组1:2、5、10、12月龄SPF级PAP小鼠和SPF级WT小鼠;分组2:5月龄SPF级WT小鼠、SPF级PAP小鼠、无菌WT小鼠和无菌PAP小鼠;分组3:5月龄SPF级WT小鼠、SPF级PAP小鼠和移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠;分组4:5月龄无菌WT小鼠、无菌PAP小鼠和移植Alistipes finegoldii JCM 1 6770的无菌PAP小鼠。2)对分组1小鼠肠道菌群进行16S rDNA测序,探讨不同月龄SPF级PAP小鼠肠道菌群改变。3)利用Morris水迷宫、旷场、新物体识别、Y迷宫和T迷宫评价分组2、3、4小鼠的认知功能。4)应用病理学检测、免疫组化、免疫荧光、免疫印迹等方法检测分组2、3、4小鼠脑组织内老年斑沉积及神经炎症。5)应用病理学检测、PAS染色、免疫印迹、酶联免疫吸附实验等方法观察分组2、3、4小鼠肠道屏障功能。6)利用转录组测序技术分析分组2小鼠脑组织内mRNA表达变化并与GEO数据库中AD患者脑组织内表达的差异基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)进行比对分析,筛选与肠道菌群改变相关的DEGs,采用qRT-PCR和免疫印迹方法对DEGs进行验证。7)在SH-SY5Y细胞系中,采用免疫印迹方法验证DEG Dusp6过表达及抑制表达对APP表达调控及其分子机制。结果1)与SPF级WT小鼠相比,5月龄时SPF级PAP小鼠肠道菌群α多样性、β多样性改变最明显。2)Y迷宫自主交替实验中,与无菌PAP小鼠相比,SPF级PAP小鼠的自发交替频率下降(p<0.05)。Y迷宫空间识别实验中,与无菌PAP小鼠相比,SPF级PAP小鼠进入新臂的频率下降,在新臂中驻留探索的时间缩短(p<0.05)。3)与SPF级WT小鼠相比,5月龄的SPF级PAP小鼠肠道内黏蛋白、紧密连接蛋白Claudin5、Occludin的表达明显下降,血清内脂多糖和IL-6和IL-10含量明显增加;脑组织内老年斑和小胶质细胞的数量显著增加(p<0.05)。4)转录组测序结果和GSE36980数据库比对结果显示,与无菌PAP小鼠相比,SPF级PAP小鼠脑组织内49个DEGs,其中19个DEGs在AD患者脑组织内也存在差异表达,通过KEGG富集分析显示,Dusp6等7个DEGs富集到MAPK信号通路(p<0.05)。5)SH-SY5Y细胞中过表达Dusp6后,ERK1/2磷酸化水平下降、Aβ的表达下降。反之,Dusp6敲低后,ERK磷酸化水平升高和Aβ表达增加,加入ERK磷酸化抑制剂后,ERK磷酸化水平和Aβ表达下降(p<0.05)。6)16S rDNA测序分析,与SPF级WT小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠肠道菌群α多样性、β多样性无明显差异。7)Morris水迷宫实验中,与SPF级PAP小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠寻找平台所需的时间明显缩短,穿越平台及所在象限的次数增多和停留时间变长(p<0.05);新物体识别实验中,与SPF级PAP小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM16770 的 SPF 级 PAP 小鼠 Discrimination index升高(p<0.05);Y迷宫自发交替实验中,与SPF级PAP小鼠和无菌PAP小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM1 6770的SPF级PAP小鼠和无菌PAP小鼠自发交替频率升高(p<0.05),Y迷宫空间识别实验中,与SPF级PAP小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠在新臂中探索频率和时长升高(p<0.05);T迷宫自发交替实验中,与SPF级PAP小鼠相比,移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠的自发交替频率升高(p<0.05)。8)移植Alistipes finegoldii JCM16770的SPF级PAP小鼠脑组织内老年斑的沉积减少,海马内TREM2蛋白表达增加(P<0.05),海马内小胶质细胞突起变短,变粗,呈“阿米巴”样形态。结论1)5月龄时SPF级PAP小鼠的肠道菌群改变最明显。2)SPF级PAP小鼠肠道菌群失调与认知功能损伤密切相关。3)SPF级PAP小鼠肠道菌群失调与脑组织内Dusp6蛋白表达下降、MAPK信号通路激活及老年斑的沉积相关。4)SPF级PAP小鼠肠道菌群失调与肠道屏障功能受损及炎症的发生密切相关。5)在SH-SY5Y细胞中,Dusp6蛋白可以通过抑制MAPK信号通路从而抑制Aβ的形成。6)移植Alistipes finegoldii JCM1 6770可以恢复SPF级PAP小鼠肠道稳态;改善SPF级PAP小鼠的认知功能损伤。7)移植Alistipes finegoldii JCM1 6770可以促进SPF级PAP小鼠和无菌PAP小鼠海马内TREM2表达,促进小胶质细胞对Aβ的吞噬作用,减少SPF级PAP小鼠脑组织内老年斑的形成。