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蜱是家畜家禽的一类体表寄生虫，分布广泛，可传播由细菌、病毒、立克次体、螺旋体和血液原虫等引起的多种疾病，不仅给畜牧业造成很大的经济损失，同时还影响人类健康。我国目前发现的蜱种有100多种，其中，镰形扇头蜱是我国南方的优势蜱种，主要传播牛巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病和吉氏巴贝斯虫病。目前对蜱的控制主要使用化学杀虫剂。然而，随着蜱抗药性以及畜产品的药物残留等问题的出现，寻找新的抗蜱方法就显得尤为重要。相对于化学杀虫剂来说，免疫预防被认为是一种最有前途的控制蜱的方法。据报道，半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的发育、营养等生命活动中有不可缺少的生物学功能，被认为是一类抗虫疫苗和药物研究的重要分子。本研究以镰形扇头蜱为研究对象，通过从镰形扇头蜱体内克隆半胱氨酸蛋白酶基因，并在体外表达，分析其功能，为蜱及蜱传疾病的防制作一些探索性工作。首先，根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子特性设计基因特异性引物GSP=5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’，用于3’-RACE扩增，PCR产物经纯化、连接入pGEM-T质粒载体、转化大肠杆菌DH5α和测序。根据测序结果，设计基因特异性引物用于5’-RACE扩增，cysA：GSP1=5’ -AGTGTCCAGCGTCAATGGCTA-3’，GSP2=5’-GATGTCTACAAAGCCGGTGTCGGTTG-3’，nested GSP=5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’； cysB：GSP1=5’-TAGACACCTTCCGAGTAGAAC-3’ ，GSP2=5’-CGTGGCTGGCGTCGATGGCAACTGAGAC-3’，nested GSP=5’ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’。5’-RACE的PCR产物经纯化、连接、转化和测序。根据测序结果，设计基因特异性引物用于扩增全长基因，cysA：GSP3=5’-GAGCTCTCCACCAGGTGCACC-3’， cysB：GSP3=5’-AGGTCACTTGGGGTCTC CGGC-3’ ，PCR产物经纯化、连接、转化和测序分析，结果得到两个全长基因序列，分别命名为cysA和cysB。cysA全长1168bp，编码332个氨基酸，预测分子量为36kDa；cysB全长1153bp，编码335个氨基酸，预测分子量为37kDa。经网上blast分析，这两个基因均与其它蜱种和物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性，两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列，因此确定cysA和cysB均为镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。其次，运用RT-PCR方法分析cysA、cysB在镰形扇头蜱中的分布情况，分别提取镰形扇头蜱的各发育阶段包括卵、幼蜱、若蜱、未吸血成蜱、半饱血成蜱和不同部位包括壳、唾液腺、肠的总RNA，取相同的量的总RNA进行RT-PCR分析，结果cysA和cysB在壳和唾液腺中均有表达，在各发育阶段也都有不同程度的表达，其中，cysA在卵中表达丰度极低，cysB在未吸血成蜱中表达丰度极低。 <WP=4>再次，将cysA、cysB在原核表达系统中进行表达，结果，两者均高丰度的表达。表达产物经纯化后，进行western blot分析，结果发现抗蜱唾液血清可以识别重组蛋白Trx-cysA、Trx-cysB；同时抗重组蛋白Trx-cysA和抗重组蛋白 Trx-cysB的血清也能识别天然的抗原。表明，两者都具很好的免疫原性。最后，进行免疫保护效果分析，用重组蛋白免疫实验兔，再感染镰形扇头蜱，观察保护效果。观察结果经分析表明，重组蛋白Trx-cysA免疫组和Trx-cysB免疫组均可降低成蜱的吸附率，经t检验与对照组相比均差异显著（P＜0.05）；并且，两实验组均可降低若蜱和成蜱的饱血率，经t检验与对照组相比均差异显著（P＜0.05）。综上所述，本研究成功地克隆到镰形扇头蜱的两个半胱氨酸蛋白酶基因，并登录Genebank；经原核表达的重组蛋白有很强的免疫原性，且有一定的抗蜱免疫保护效果，为抗镰形扇头蜱疫苗的研制提供了新的候选疫苗分子，对蜱及蜱传疾病的防制具有重要意义。