论文部分内容阅读
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,简称Vp)是一种广泛分布于海洋与盐湖中的致病性嗜盐细菌,海产品(特别是贝类)中常有此菌,它是引起食源性疾病的主要病原之一,食用这种被染有副溶的生鲜或未煮熟的海产品可能会导致急性肠胃炎,其症状为腹泻,头痛,呕吐,恶心以及腹部绞痛[1]。根据国家食源性疾病监测网对我国13个地区食源性疾病爆发情况的监测数据,自1992～2001年的十年间共上报食物中毒事件5770起,患者人数达162995人,其中由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人数最多,分别占总体的38.5％和50.9％。在细菌性食物中毒的构成中,又以副溶血性弧菌引起的急性肠胃炎占首位[3]。而根据1998年以来的数据,副溶血性弧菌食物中毒已在数量上超过沙门氏菌中毒案例,成为我国的首要食源性致病菌,特别是在一些沿海城市,由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒总数的比例高达60％以上[5—8]。
本文通过小鼠毒力试验比较了5株副溶血性弧菌菌株的致病性；比较不同因子对制备副溶血性弧菌的外膜蛋白的效果,利用SDS—PAGE观察比较不同菌株外膜蛋白的电泳图谱,确定致病性副溶可能有的共同的保护性抗原。进一步制备出副溶血弧菌菌体及多克隆抗体,通过辛酸硫酸铵两步法纯化抗体,ELISA测定抗体效价,Westernblot检测血清识别的主要蛋白带。将所获得的菌体血清和外膜蛋白对小鼠进行主动保护性试验和被动保护性试验,比较其效果。
本课题主要围绕以下几方面开展了一些研究:
1副溶血弧菌致病性的研究
将5株Vp菌株接种于TSA+3％NaCl斜面,28℃培养24h,用无菌PBS液(pH7.2—7.4)洗脱至TCBS平板中,培养24h后PBS洗脱制成菌悬液,调整菌液浓度为l×109个/ml,然后腹腔注射小白鼠,剂量为0.4ml/只,对照组注射无菌PBS液.注射后消毒小白鼠体表,置于鼠笼中喂养.逐日观察,记录发病及死亡情况.结果表明不同副溶血性弧菌菌株对于小鼠的致病性不同,死亡率最高可达83.3％.将试验菌接种到血液琼脂平板培养基上,经过28℃培养18—24h后,5株副溶菌株均能在我萋血平板上形成溶血圈,表明其含有TDH基因,具有明显的致病性.
2副溶血弧菌菌体多克隆抗体的制备及纯化
受免动物血清抗体效价是评价特异性免疫效果的一个主要指标,抗体效价的高低通常显示了免疫的成败.利用0.05％(V/V)甲醛、30℃将标准菌株V.p1.2164灭活4h,制备免疫抗原,对新西兰大白兔进行耳静脉注射后,采血吸取上层血清并离心去除红细胞,辛酸硫酸铵二步法纯化所得抗体[9]:采用间接ELISA法测定效价为1.6×105,且与其他菌株均无交叉反应,能够满足免疫试验的需要.间接ELISA最佳参数为:60℃烘干包被,抗原包被浓度为107 cfu/mL；封闭时间2.5h；一抗工作稀释度为1:4000；抗原、一抗孵育时间为75min；酶标二抗工作稀释度为1:1000；一抗与酶标二抗孵育时间为60min；酶与底物反应温度为30℃,时间为15min；孵育温度为37℃.
3副溶血弧菌外膜蛋白的提取及免疫鉴定
将副溶菌株接种在3种不同培养基平板上,利用PMSF法提取外膜蛋白.结果表明,在TSA+3％NaCl中的表达的蛋白含量略高于其他三种培养基,在培养4h后即开始有OMP出现,到24h后到达高峰,此后逐渐呈下降趋势.在不同温度下培养Vp时发现在28℃表达的外膜蛋白含量更高,且主要蛋白带更明显.5株具有明显致病性的Vp在外膜蛋白SDS电泳图谱上十分相似,主要有9—15条蛋白带,主要集中在66kD和20kD之间,其中5条主要蛋白带为所有菌株所共有,其大致分子量为:85kD,50kD,40kD,33kD,24kD.不同菌株主要蛋白质的数量和含量有所不同.Westernblot表明纯化后的血清与所有菌株均有两条明显的免疫反应带,其大致分子量约为33kD和40kD.这两条外膜蛋白有可能是致病性副溶血弧菌的主要保护性抗原,具备作为疫苗的候选材料的可能性.
4主动保护性和被动保护性试验
利用制备的外膜蛋白和免疫血清进行主动保护性和被动保护性试验,发现前者的保护性效果高于后者,说明OMP具有较强的免疫原性.