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水稻作为主要的粮食作物之一,是世界近一半人口的主食。全球人均膳食能量的四分之一是由上万个水稻品种提供的。在作物生长发育所必需的营养元素中,磷是影响植物生长的主要限制因子之一。植物根系能够直接吸收利用的磷主要为无机态正磷酸盐(inorganic phosphate;Pi;H2PO4-),然而土壤中Pi极易被固定,使磷的有效性很低。在缺磷环境中,植物可在转录水平调控众多基因的表达以在生理代谢、形态等方面做出相关的适应性调整。转录因子是植物生长发育及应对各种生物、非生物胁迫的重要调控因子,其通过与下游基因启动子区的顺式调控元件(cis-regulatory element)结合,在转录水平调控这些基因的表达。近年来,越来越多的转录因子基因被报道响应植物缺磷信号,参与维持植物体内磷的动态平衡过程。根据它们与目的基因的结合结构域(DBD;DNA Binding Domain),具体分为 AP2/EREBP,ARF,BES1,bHLH,bZIP,G2-like,MYB,WRKY,和Zinc Finger九个转录因子家族。迄今植物中研究最广泛的参与缺磷信号调控途径的转录因子是属于MYB-CC亚家族的PHR(Phosphate Starvation Response)。水稻中,除了 MYB-CC亚家族的OsPHR2外,还有bHLH(OsPTF1),ARF(OsARF12/16)和MYB家族其他成员(OsMYB2P-1/4P),被报道参与植物的缺磷信号转导、维持植物体内磷的动态平衡。但是,在水稻中报道的缺磷相关转录因子基因,没有一个来自WRKY家族。本研究从水稻中鉴定到一个响应缺磷信号的WRKY转录因子基因OsWRKY72,并研究了其功能,取得了如下主要研究结果:1.通过生物信息学分析,OsWRKY72定位于11号染色体,编码WRKY家族的C2H2型转录因子,由两个外显子和一个内含子组成,其开放阅读框全长729 bp,编码242个氨基酸。2.采用基因枪轰击洋葱表皮、基因芯片和RT-qPCR技术发现OsWRKY72定位于细胞核,在水稻苗期和成熟期的各组织器官中均有表达,并且其表达丰度在成熟期较幼苗期高。在幼苗期,OsWRKY72在根部响应缺磷信号表达发生下调,在地上部则不响应缺磷信号。在组织定位方面,对OsWRKY72启动子融合GUS报告基因的转基因水稻分析结果显示,在地上部OsWRKY72的表达主要在维管组织中,而在根部GUS活性则主要集中在根尖的分生区和伸长区以及侧根原基发生区。3.通过根癌农杆菌介导的转基因技术获得了 OsWRKY72过量表达和RNAi(RNA interference)敲除转基因水稻植株,以及OsWRKY72过量表达的拟南芥(Arabidopsis thaliana)材料。OsWRKY72过量表达转基因水稻植株矮小、株型松散、花粉育性下降、结实率降低;Os WRKY72敲除材料的生长也受到抑制,但结实率与野生型相比没有差异。OsWRKY72过量表达在拟南芥中导致的表型与水稻中部分类似,即生长受到抑制。4.将OsWRKY72过量表达、敲除和野生型水稻植株,在水培条件下施加不同磷水平处理。与野生型相比OsWRKY72过量表达材料和敲除材料地上部均生长受到抑制。在正常供磷条件下,OsWRKY72过量表达水稻植株叶片中的无机磷和总磷含量均提高,根部则无显著差异;在低磷条件下,各组织中磷含量无变化。OsWRKY72敲除材料在不同磷水平条件下的各组织部位中,磷含量较野生型均无显著差异。OsWRKY72过量表达拟南芥植株中,总磷含量的变化与水稻中的趋势一致,即在地上部增加且在根部无明显变化。5.通过 RT-qPCR 分析了 OsWRKY72 对 PHT1(Phosphate Transporter 1)家族和部分缺磷诱导(PSI;Phosphate Starvation Induced)基因表达的影响结果显示,OsWRKY72参与调控水稻缺磷信号转导途径,PHT1家族中有OsPT3,OsPT6和OsPT10三个受缺磷诱导表达最强的PHT1家族基因,在缺磷的OsWRKY72敲除材料中表达受抑制;正常供磷条件下,过量表达水稻植株中只有OsPT12 一个PHT1家族成员发生显著上调。PSI基因OsIPS1,OsSQD2,OsPAP 0和OsPHO2.2在缺磷的OsWRKY72敲除材料根部的表达显著降低。6.在正常供磷(+P:200μM)和缺磷(-P:0μM)条件下,对OsWRKY72过量表达水稻植株进行了根系构型分析,结果显示OsWRKY72影响了初生根、侧根和不定根的生长。无论在+P或-P条件下,与野生型植株相比OsWRKY72过量表达水稻植株的初生根长度增加,平均侧根长度和不定根数量下降,表明OsWRKY72对初生根长度、侧根长度和不定根发生的调控独立于磷信号途径。反之,OsWRKY72对侧根发生的调控则是依赖于磷水平的,其过量表达水稻植株的侧根密度只在缺磷条件下提高约20%。7.采用Affymetrix基因芯片结合RT-qPCR对OsWRKY72过量表达转基因水稻植株及野生型植株的表达谱进行了分析,结果显示与野生型植株相比OsWRKY72过量表达水稻植株中一个编码AUX/IAA家族转录因子的基因,即OsIA41的表达发生强烈上调。已有报道OsIAA1过量表达水稻植株与OsWRKY72过量表达植株的表型极为相似,即植株矮化、叶片夹角增大。此外,OsIAA1启动子区含有多个WRKY转录因子的结合元件W-box,表明OsWRKY72可能是OsIAA1上游直接的调控因子,通过激活OsIAA1的表达调控生长素信号途径,继而影响水稻地上部的株型。