论文部分内容阅读
茶树(Camellia sinensis)是一种典型的富铝(A1)嗜氟(F)植物,其累积A1和F的机制与茶树细胞壁构建密切相关,但具体机制仍不清晰。木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(Endotransglycosylase/hydrolases,XTH)主要作用是使木葡聚糖链断裂和重连,修饰细胞壁中纤维素-木葡聚糖复合结构,使细胞壁进行重构;同时,XTH还能够将新合成的木葡聚糖分子进行催化,使其转移到初始细胞壁网络结构上,达到在细胞壁重构过程中保持厚度和完整度的目的。已有研究显示,XTH在茶树耐铝过程中起关键作用,而在茶树耐氟中的作用未见报道。本研究在已有转录组数据库中筛选、鉴定出14个茶树XTH基因,通过5组不同浓度铝(0、0.1、0.4、2.0和4.0 mM)和3组不同浓度氟(0、8、16 mg/L)处理,分析各个基因的表达情况。通过测定XET(Xyloglucan endotransglucosylase)的活性和标记不同取代程度的木葡聚糖,以期探讨XTH参与茶树富铝嗜氟的机制。从本课题组已有茶树转录组数据库中查找并筛选出45条XTH相关的序列,进一步鉴定后得到14个基因,并将这些基因命名为CsXTH1-CsXTH14。将茶树14个CsXTHs利用MEGA和拟南芥的33个AtXTHs构建无根系统发育树,根据拟南芥的分类标准,将其进一步分为3个亚族。CsXTH6、-7、-11和-14属于亚族Ⅰ;CsXTH2、-4、-5、-13属于亚族 Ⅱ;CsXTH1、-3、-9 属于亚族 ⅢA;CsXTH8、-10、-12属于亚族ⅢB。根据进一步的序列比对结果推测,N(天冬氨酸)-糖基化位点是XTH行使XET活性必不可少的结构。为进一步研究CsXTH基因家族的功能,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析它们在龙井43茶树不同组织中的相对表达情况。结果显示:14个CsXTH基因在茶树中的表达具有显著的组织特异性。其中,CsXTH2、-3、-8和-13在根中的表达量较高;CsXTH2、-3、-7、-9和-11在茎中表达量较高;CsXTH3、-6、-10和-11在嫩叶中表达量较高;CsXTH1、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-14在花中表达量较高;CsXTH12在花粉中表达量较高;CsXTH1、-4、-5和-7在果实中表达量较高;而在老叶中,表达量均相对较低,推测可能的原因是CsXTH和茶树的生长有关,老叶生长缓慢,因此,其表达量相对更低。为探讨CsXTH基因在茶树耐铝氟中的作用,用不同浓度的铝和氟处理茶苗后,对其表达进行定量分析。结果显示,与未加铝处理相比,CsXTH7、-9、-13和-14在铝浓度为0.4 mM时,表达量均有所提高,其中CsXTH7最为明显。在不同浓度氟处理下,CsXTH1、-4、-6、-7、-8、-12、-13和-14,在氟浓度为8 mg/L时,表达量达到最高。利用免疫荧光标记测定在不同浓度铝和氟的处理下,茶树根中木葡聚糖和木葡聚糖聚合物含量变化。结果显示,当铝浓度为0.4 mM、氟浓度为8 mg/L时,LM25(识别木葡聚糖聚合物)亮度达到最亮,说明此时的浓度促进茶树根部的生长。利用双抗体夹心法测定不同处理下茶树根系中XET活性,结果显示,当铝浓度为0.4 mM和氟浓度为8 mg/L时,XET活性与对照组相比明显提高,当浓度继续上升,活性也随之下降,这一变化趋势与荧光标记结果相一致。