梓醇对LPS损伤下施万细胞的影响及作用机制研究

• 作 者: 李珊
• 出 处: 北京中医药大学
• 发表日期: 2020年01期
• 关键词: 超氧化物歧化酶 大鼠施万细胞系96 共培养 神经元 氧化应激 梓醇

目的:1体外培养大鼠施万细胞系(rat Schwann cell,RSC)96,观察RSC 96的生物学特性。2观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对RSC 96的作用及对超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表达的影响。3研究地黄提取成分梓醇对LPS损伤条件下RSC 96的保护作用及对SOD的表达的影响。4探索RSC 96与原代神经元的体外共培养的条件。方法:1体外培养RSC 96,通过S100、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色鉴定,观察RSC 96不同时间形态结构。2通过体外培养 RSC 96,选用不同浓度 LPS(0μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml、640μg/ml)对RSC 96损伤24h、48h、72h,观察细胞的形态结构、细胞贴壁数量、CCK-8试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活性,建立LPS损伤时间浓度梯度模型,选取合适的损伤浓度和时间。160μg/ml LPS对RSC 96损伤0h、24h、48h、72h,设立正常对照组、LPS损伤24h组、LPS损伤48h组、LPS损伤72h组,SOD荧光染色,Image J软件分析荧光强度,光密度(optical density,OD)值表示SOD表达的变化。3给予不同浓度梓醇(0μmol/ml、25μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml)对正常RSC 96及160μg/ml LPS损伤条件下的RSC 96干预72h。观察RSC 96形态结构、细胞贴壁数量、CCK-8检测细胞活性,选取最佳干预浓度。设立正常对照组、模型组、梓醇干预组,观察RSC 96形态结构、细胞贴壁数量、突起长度、CCK-8检测细胞活性。给予不同浓度梓醇(0μμmol/ml、25μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml)对160μg/ml LPS损伤条件下的RSC 96干预72h,设立正常对照组、模型组、LPS+25μmol/ml 梓醇组、LPS+50μmol/ml 梓醇组、LPS+100μmol/ml 梓醇组,SOD免疫荧光染色,采用Image J软件分析荧光强度,荧光强度OD值表示SOD表达的变化。4大鼠胚胎提取原代神经元,通过神经元树突标志物:微管相关蛋白(microtubule-associated protein-2,MAP-2)免疫荧光染色鉴定。通 DAPI、MAP-2染色阳性结果,计算DAPI染色阳性细胞中MAP-2染色阳性细胞占的比例,得出原代神经元纯化率。原代神经元与RSC 96以500:3比例共培养于共培养培养基中,观察两种细胞生存状态,S100及tubulin免疫荧光染色。结果:1 RSC 96通过S100、GFAP免疫荧光染色鉴定为SC,其型状呈现梭型,胞体圆润饱满,核为卵圆形,突起细长符合SC生物学特性。2 RSC 96的CCK-8 OD值随着LPS损伤时间延长、浓度增加,细胞活性降低。LPS浓度损伤16μg/ml,时间72h,可形成半损伤模型,损伤程度最佳。SOD表达水平随LPS损伤时间延长而降低。3通过不同浓度梓醇对正常RSC 96及160μg/ml LPS损伤条件下RSC 96干预72h,发现梓醇浓度为50μmol/ml,细胞贴壁数量最多、CCK-8 OD值最大,为最佳干预浓度。与正常对照组比较,模型组的CCK-8 OD值显著降低(P<0.01),细胞贴壁数量减少(P<0.01),细胞突起显著缩短。梓醇干预组和模型组比较,梓醇能显著提高细胞的CCK-8 OD值(P<0.01),增加贴壁细胞数量(P<0.01),细胞突起伸长。不同浓度梓醇对160μg/ml LPS损伤条件下RSC 96干预72h,与模型组比较,梓醇干预LPS损伤下LPS 96 SOD表达均显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。4提取原代神经元通过MAP-2鉴定为神经元,其纯化率>90%。在共培养培养基中,原代神经元:RSC 96=500:3条件下两种细胞可以共存。S100及tubulin免疫荧光染色呈阳性结果。结论:1 RSC 96通过S100、GFAP免疫荧光染色鉴定为SC,其符合SC生物学特性。2 LPS损伤RSC 96随时间延长、浓度增加,细胞活性降低。SOD表达水平随着LPS损伤时间延长而降低。3梓醇具有保护LPS损伤条件下的RSC 96,升高SOD表达水平作用。4通过细胞共培养,发现RSC 96与原代神经元可以在体外共存活。