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研究目的:胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,是癌症患者死亡的主要原因之一。在我国胃癌是发病率和死亡率均居第二位的恶性肿瘤。虽然近年来胃癌的诊断和治疗方法取得了一些进步,但胃癌患者的预后仍较差,5年生存率低于20%,复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。胃癌的早期诊断和治疗可降低胃癌患者的死亡率,然而我国早期胃癌的诊治率较低,绝大多数患者在就诊时已经是进展期或者晚期,错过了最佳手术期,这些病人即使接受了根治性手术和化疗,术后复发率和死亡率仍然较高。深入研究胃癌发生发展的分子机制,鉴定新的干预靶点,对于胃癌的早期诊断和治疗都具有重要的意义。胃癌是一种多因素参与的疾病,在其发生发展过程中,涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活和相关信号通路的异常表达等一系列复杂的分子事件发生。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类广泛存在于真核生物中的、长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的新型RNA分子。随着研究的深入,研究者发现lncRNA具有多种生物学功能,参与真核生物的转录、转录后、表观遗传学等多种途径的基因调控,参与多种生理和病理过程的调控。而且lncRNAs在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤细胞中异常表达,参与肿瘤的起始和进展。阐明lncRNAs在胃癌发生和转移过程中的作用和分子机制,可更全面的理解疾病的发生机理,lncRNAs可成为胃癌诊断的分子标志物和治疗靶点。为了探究lncRNA在胃癌发生和进展过程中的作用,本研究收集临床胃癌患者的肿瘤组织和癌旁非肿瘤胃粘膜,利用高通量lncRNA表达谱芯片筛选两种组织中差异表达的lncRNAs。然后应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测筛选出的lncRNAs在另外的新鲜胃癌组织及癌旁非肿瘤胃粘膜样本中的表达。结果显示,lncRNA KRT19P(Keratin 19 Pseudogene3)在胃癌组织中表达显著下调(absolute fold change=8.58,P=1.92X 10-6),我们选取 lncRNA KRT19P3 进行深入研究。我们分析KRT19P3的表达与临床病理参数和预后的关系,并检测KRT19P3在胃癌细胞中的亚细胞定位。通过体内外功能学实验研究了 KRT19P3对胃癌SGC7901和MKN45细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响。并使用RNA pull-down、质谱分析、免疫沉淀实验(RIP)和Western blot等方法初步探究了 KRT19P3的直接结合蛋白和其下游相关信号通路,阐明其在胃癌增殖和转移过程中的作用机制,为进一步发现胃癌早期诊断、确定靶向治疗的靶点及判断预后的新的分子标志物提供了理论依据。研究方法:1、应用高通量lncRNA表达谱芯片筛选胃癌与非肿瘤胃粘膜组织中存在的差异表达lncRNAs。收集新鲜的胃癌组织标本10例、非肿瘤胃粘膜组织标本2例进行lncRNA芯片检测。对胃癌与非肿瘤胃粘膜组织中的lncRNAs表达谱进行对比,按照lncRNAs在胃癌组织中表达上调变化比值>2.0或下调变化比值<0.5,同时P<0.05的标准进行差异lncRNAs的初步筛选。2、另外收集独立的84例胃癌和20例非肿瘤胃粘膜样本,应用RT-qPCR方法检测筛选出的lncRNAs在各样本中的表达,验证芯片的检测结果,选择lncRNA KRT19P3进行进一步验证及深入的功能学及机制研究。分析KRT19P3的表达与胃癌患者的年龄、肿瘤大小和分化程度、TNM分期等临床病理参数及预后之间的相关性。通过质核分离,RT-qPCR分别检测细胞浆和细胞核内KRT19P3的表达,确定其在胃癌细胞中的亚细胞定位。3、细胞增殖、凋亡的检测。将KRT19P3的过表达质粒或KRT19P3 siRNA及相应的对照质粒或siRNA转染胃癌SGC7901和MKN45细胞,RT-qPCR检测转染效率,CCK-8和EdU实验检测KRT19P3的表达变化对胃癌细胞增殖能力的影响,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡率的变化。4、细胞迁移、侵袭的检测。普通Transwell小室和基质胶侵袭实验检测表达变化KRT19P3对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。5、动物学实验。采用慢病毒感染的方式建立稳定过表达KRT19P3的胃癌细胞系,再将感染后的胃癌细胞经过皮下或鼠尾静脉注射入裸鼠体内。5周后与对照组相比,观察裸鼠皮下成瘤和向远处脏器转移的情况。体内分析KRT19P3对胃癌细胞的增殖、浸润及转移的影响。6、KRT19P3在胃癌中作用的分子机制研究。以pcDNA 3.1(+)-KRT19P3和pcDNA 3.1(+)-antisense-KRT1 9P3载体为模板,体外转录合成生物素标记的KRT19P3和其antisense RNA。RNA pull-down、质谱分析结合蛋白定位及文献报道筛选KRT19P3在胃癌细胞中的结合蛋白,应用Western blot和RNA免疫沉淀(RIP)技术进一步验证KRT19P3作用的靶蛋白,通过挽救实验、Western blot、荧光素酶实验检测其调控的信号通路。7、统计学分析。Student’s t-test或one-way ANOVA分析两组或两组以上计量数据。运用卡方检验分析KRT19P3的表达与胃癌患者临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier和Cox回归检验法分析KRT19P3的表达与胃癌患者生存的关系。所有数据分析P<0.05表示统计学意义。结果:1、lncRNAKRT19P3在胃癌中的表达情况。高通量lncRNA表达谱芯片结果显示:相较于非肿瘤胃粘膜组织,在胃癌组织中检测出579个显著下调的基因,同时有1075显著上调的基因(基因芯片信息请见 GEO:GSE72307)。其中 lncRNA KRT19P3(Keratin 19 Pseudogene 3,Ensemble ENST00000507547,absolute fold change=8.58,P=1.92×10-6)被选为进一步验证的lncRNA。利用在线网站对KRT19P3进行基因学特征的综合查找,确定其为基因间lncRNA,位于4号染色体。RT-qPCR检测结果显示lncRNA KRT19P3在胃癌组织中表达量低于非肿瘤胃粘膜组织,与lncRNA芯片检测结果一致。而且lncRNA KRT19P3在非转移组中表达水平明显高于转移组。KRT19P3的表达水平与胃癌的肿瘤直径、TNM分期、Lauren’s分型及淋巴结转移相关。而且Spearman相关性分析发现KRT19P3的表达水平与胃癌的肿瘤直径呈负相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示KRT19P3的表达与胃癌患者生存预后密切相关。RT-qPCR分析发现KRT19P3在胃癌细胞中主要定位于细胞核,细胞质中只有少量表达。2、KRT19P3对胃癌细胞生物学功能的影响。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,转染KRT19P3过表达质粒可显著上调KRT19P3的表达,而转染KRT19P3 siRNA则显著地沉默了 KRT19P3的表达。胃癌细胞SGC7901和MKN45转染KRT19P3过表达质粒或KRT19P3 siRNA后,进行细胞功能学实验。实验结果表明,KRT19P3过表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润,诱导细胞凋亡,而沉默KRT19P3的表达则可促进胃癌细胞的增殖、迁移和浸润,抑制细胞凋亡。而且我们进一步利用动物实验在体内验证以上的实验结果。动物学实验发现:过表达KRT19P3后,裸鼠的皮下移植瘤生长速度较慢,瘤体比对照组小,发生包膜浸润的比例低。在转移瘤模型中,上调KRT19P3的表达后裸鼠肺部转移灶比对照组少,而且转移灶的镜下面积也较小。动物实验表明,KRT19P3在体内抑制胃癌细胞的生长、浸润和转移。3、KRT19P3在胃癌中异常表达的分子机制的初步探究。RNA pull-down实验后,将KRT19P3拉下的差异蛋白条带进行质谱检测。然后对这些蛋白进行文献检索及生物信息学分析,结合已有文献对蛋白功能的报道及蛋白定位,我们选择COPS7A作为潜在结合蛋白进行后续研究。我们又应用Western blot和RNA免疫沉淀(RIP)技术验证COPS7A为KRT19P3的特异性结合蛋白。RT-qPCR和免疫组化检测发现COPS7A在胃癌组织中低表达,Spearman相关分析发现胃癌组织中KRT19P3表达水平与COPS7A蛋白水平呈正相关。KRT19P3在蛋白水平均影响COPS7A的表达,KRT19P3可调节COPS7A的蛋白稳定性。细胞挽救实验表明过表达COPS7A可部分恢复KRT19P3对胃癌细胞增殖和转移的抑制,即KRT19P3是通过COPS7A抑制胃癌细胞增殖和侵袭。Western blot和体外泛素化实验结果显示COPS7A可使IκBα蛋白发生去泛素化,减少其泛素化降解,从而提高IκBα的蛋白水平。荧光素酶报告基因检测显示过表达COPS7A通过减少IκBα蛋白的泛素化降解从而抑制NF-κB通路的活性。而干扰KRT19P3的表达可提高NF-κB信号通路的活性,KRT19P3 siRNA和COPS7A过表达质粒共转染胃癌细胞可减弱沉默KRT19P3对NF-κB信号通路活性的促进作用。Western blot检测发现干扰KRT19P3可上调p65的磷酸化水平,同时使IκBα的表达量下降,p65总蛋白的含量保持不变。在上述细胞中再转染COPS7A过表达质粒则可减弱KRT19P3对p-p65和IκBα表达的调控作用。以上实验结果阐明在胃癌细胞中KRT19P3通过失活NF-κB信号通路抑制胃癌细胞增殖和侵袭。结论及意义:1、通过lncRNAs表达谱分析及RT-qPCR验证筛选出胃癌组织中显著低表达的lncRNAKRT19P3,KRT19P3的表达水平与胃癌的大小、TNM分期、Lauren’s分型及淋巴结转移相关。低表达的KRT19P3预示胃癌患者较差的临床预后。KRT19P3主要表达在细胞核。2、体外细胞学实验结果显示KRT19P3能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润,促进凋亡;体内动物实验发现KRT19P3能够减弱胃癌细胞的增殖和转移能力,表明KRT19P3能够从多个方面抑制胃癌进展。3、COPS7A为KRT19P3的特异性结合蛋白,KRT19P3可促进COPS7A蛋白表达,通过使IκBα蛋白发生去泛素化,失活下游NF-κB信号通路从而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。本研究为KRT19P3成为胃癌新的诊断预后标志物和治疗靶点提供了理论基础。